M Ở ĐẦU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
. .1 hi ị nghi n cứ
Phổ 1
H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đƣợc ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR và TMS đƣợc sử dụng là chất chuẩn nội. Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Electrothermal IA-9200 (Anh). Phổ ESI-MS đo trên máy HP-1100 LC/MS Trap.
Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) và các vết chất đƣợc phát hiện bằng cách phun thuốc thử dung dịch Ninhydrin hoặc thuốc thử KMnO4. Các hóa chất và dung môi đƣợc cất lại và làm khan trƣớc khi sử dụng bằng các phƣơng pháp tiêu chuẩn. Sắc ký cột đƣợc thực hiện trên silica gel (Merck silica gel Si 60 (40-63 mm).
2.3.2 Phân lập các hợp chất
Các mẫu tƣơi của Anthenea aspera (10 kg) đã đƣợc cắt thành miếng nhỏ và ngâm chiết ba lần với ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40ºC. Dịch tổng thu đƣợc đƣợc cất kiệt dung môi dƣới áp suất giảm, nhiệt độ< 50ºC thu đƣợc 213g cặn chiết tổng EtOH. Cặn chiết này đƣợc chiết phân đoạn lần lƣợt với hexane (1L x 3), EtOAc (1Lx3) và Butanol (1Lx3) thu đƣợc các cặn chiết tƣơng ứng: 45g cặn hexane
kí hiệu: SDH, 68g cặn ethyl acetate kí hiệu: SDE và 96g cặn butanol kí hiệu: SDM. Cặn SDH đƣợc tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải hexane/CH2Cl2 và CH2Cl2/MeOH (100-0% 100% v:v) thu đƣợc 9 phân đoạn kí hiệu SDH1-SDH9 tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải hexane/CH2Cl2 và CH2Cl2/MeOH thu đƣợc 3 hợp chất: SD1 (0,93g), SD2 (0,45g), SD3 (1,05g)
Sơ đồ 1. Sơ đồ phân lập chất của sao biển Anthenea Aspera
2.4. Dữ liệu phổ của các chất phân lập đƣợc SD1: 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm): 5,33 (2H, m, 2x H-9’ và H-10’); 5,19 (1H, m, H-2); 4,31 (1H,dd, J=3,5 và 12,0Hz, H-1); 4,15 (1H, dd, J=6,5 và 11,9Hz, H-3); 3,53 (1H, dd, J=2,0 và 5,3Hz, H-); 2,31 (4H, m, 2x H-2’ và H-2”); 2,0 (4H, m, 2x H-8’ và H-11’); 1,57 (9H, 2x H-3’ và H-3”); 1,28 (40 × CH2); 0,88 (9H, 2x H-18’ và H-18”). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), (ppm): 173,44 (s, C-1); 173,10 (s, C-1’); 130,02 (d, C-7); 129,72 (d, C-8); 71,78 (t, C-3); 70,12 (d, C-2); 68,98 (t, C-2’”), 62,79 (t, C-1); 34,36 (t, C-2’); 34,17 (t, C-2”); 31,93 (t, 2 × C-8’ và C-11”); 31,79 (t, 2×C- Cắt nhỏ, Chiết bằng EtOH Siêu âm, 400C 10 kg tƣơi
213g cao chiết EtOH 100(g) 45g cao chiết Hexane 68g cao chiết EtOAc 96g cao chiết BuOH
Chiết với dung môi Hexane, EtOAc, BuOH
SDH1 SDH2 SDH3-SDH9 CC hexane/CH2Cl2 100:100 CH2Cl2/MeOH SD2 (0,45g) SD3 (1,05g) SD1 (0,93g) CC hexane/CH2Cl2 100/0:0/100 CH2Cl2/MeOH
16’ và C-16”); 29,71 (t, 36×CH2); 27,24 (t, C-15”); 27,19 (t, C-); 24,97 và 24,93 (t, 2 × C-3’ và C-3”); 22,69 (t, 2 × C-17’ và C-17”) và 14,10 (q, 2 × C-18’ và C-18”). SD2: 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm): 5,33 (2H, m, 2x H-9’ và H-10’); 5,19 (1H, m, H-2); 4,32 (1H,dd, J=3,5 và 12,0Hz, H-1); 4,15 (1H, dd, J=6,5 và 11,9Hz, H-3); 3,53 (2H, dd, J=2,0 và 5,3Hz, H-); 2,31 (4H, m, 2x H-2’ và H-2”); 2,0 (4H, m, 2x H-8’ và H-11’); 1,57 (9H, 2x H-3’ và H-3”); 1,28 (37 × CH2); 0,88 (9H, 2x H-18’ và H-18”). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), (ppm): 173,44 (s, C-1); 173,11 (s, C-1’); 130,02 (d, C-7); 129,72 (d, C-8); 71,78 (t, C-3); 70,12 (d, C-2); 68,98 (t, C-2’”), 62,79 (t, C-1); 34,36 (t, C-2’); 34,17 (t, C-2”); 31,94 (t, 2 × C-8’ và C-11”); 31,79 (t, 2×C- 16’ và C-16”); 29,71 (t, 34×CH2); 27,24 (t, C-15”); 27,19 (t, C-); 24,97 và 24,93 (t, 2 × C-3’ và C-3”); 22,69 (t, 2 × C-17’ và C-17”) và 14,10 (q, 2 × C-18’ và C-18”). SD3: 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm): 5,34 (2H, m, 2x H-9’ và H-10’); 5,25 (1H, m, H-2); 4,28 và 4,30 (2H,dd, J=4,5Hz, H-1), 4,12 và 4,14 (2H, dd, J=6,0Hz, H-3); 2,31 (6H, m, 2x H-2’ và H-2”); 2,0 (4H, m, 2x H-8’ và H-11’); 1,60 (6H, 2x H-3’ và H-3”); 1,28 (31CH2); 0,88 (9H, 2x H-18’ và H-18”). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3), (ppm): 173,29 (s, 2 × C-1’); 172,87 (s, C-1”); 129,84 (d, 2 × C-9, C-10); 68,91 (d, C-2), 62,12 (t, C-1 và C-3); 34,07 (t, 2× C-2’ và C-2”); 31,93 (t, 2 × C-8’ và C-11”); 31,79 (t, 2×C-16’ và C-16”); 29,63 (t, 26×CH2); 27,23 (t, C-15”); 24,92 (t, 2 × C-3’ và C-3”); 22,69 (t, 2 × C-17’ và C- 17”) và 14,10 (C-18’); 13,98 (C-18”).
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hợp chất SD1 thu đƣợc ở dạng dầu. Các số liệu phổ1
H và 13C-NMR cho biết chất
SD1 đƣợc nhận dạng là một lipid. Các tín hiệu trên phổ13
C-NMR và DEPT cho biết sự có mặt của các nhóm ester carbonyl tại C (173,29; 173,10). Hơn nữa các số liệu phổ
1
H và 13C-NMR lại cho biết trong phân tử chỉ có một nối đôi tại C 129,72 / H 5,34 (2H,m). Điều này khẳng định nối đôi thuộc mạch nhánh C-2”. Điều này cho thấy glyceride này có một acid không no mang một nối đôi ở vịtrí đối xứng nhau.
Hình 3.1. Phổ1
Hình 3.2. Phổ13
C-NMR và phổ DEPT của hợp chất SD1
Phổ1
H-NMR chỉ ra sự có mặt của một nhóm metylcacbinol [H 4,28/4,30 (2H) và C 62,12] và một nhóm metincacbinol [H 5,25 (1H)/ C 70,12]. Dựa trên phần mềm mô phỏng phổ ECD xác định SD1 là một glyceride. Ngoài ra các giá trị phổ thu nhận đƣợc so với tài liệu tham khảo khẳng định chất SD1 đƣợc xác định là một triglyceride có một nối đôi có công thức: C60H114O5.
O O O C19H37 C17H35 C19H39 1 1'' 2 1' 3 CO CO Hợp chất SD2 thu đƣợc ở dạng dầu. Các số liệu phổ 1 H và 13C-NMR cho biết chất SD2 đƣợc nhận dạng cũng là một lipid. Các tín hiệu trên phổ 13 C-NMR và DEPT cho biết sự có mặt của các nhóm ester carbonyl tại C(173,44; 173,11). Cũng tƣơng tự nhƣ SD2, các số liệu phổ1
H và 13C-NMR cũng cho biết trong phân tử chỉ có một nối đôi tại C 129,72 / H 5,34 (2H,m). Các tín hiệu trên phổ1
H-NMR giống với SD2, chỉcó điều khác biệt đó là số proton của nhóm CH2ít hơn 4 proton.
Hình 3.3. Phổ1
H NMR của hợp chất SD2
Hình 3.4. Phổ13
C-NMR và phổ DEPT của hợp chất SD2
Phân tích các số liệu phổ của chất SD2 và kết hợp phần mềm mô phỏng phổ ECD xác định SD2 là một glyceride có một nối đôi có công thức: C58H112O5.
O O O C19H37 C17H35 C17H35 1 1'' 2 1' 3 CO CO Hợp chất SD3 thu đƣợc ở dạng dầu. Các số liệu phổ 1 H và 13C-NMR cho biết chất SD3 đƣợc nhận dạng là một lipid. Các tín hiệu trên phổ 13 C-NMR và DEPT cho biết sự có mặt của các nhóm ester carbonyl tại C (173,29; 172,87). Trong đó cƣờng độ píc 173,29 cao gấp 2 lần cƣờng độpic 172,87, nhƣ vậy đây là một lipid có trục đối xứng bậc hai, hơn nữa các số liệu phổ 1
H và 13C-NMR lại cho biết trong phân tử chỉ có một nối đôi tại C 129,84 / H 5,34 (2H,m). Điều này khẳng định nối đôi thuộc mạch nhánh C-2”, nếu không phân tử sẽ không tồn tại đƣợc trục đối xứng bậc 2. Sựđối xứng bậc 2 của phân tử đƣợc xác định bằng cƣờng độ vạch phổ nhƣ xuất hiện 2 tín hiệu carbon olephin trên phổ13
C-NMR với cƣờng độtích phân tƣơng ứng 2H trên phổ1
H-NMR. Điều này cho thấy triglyceride này có một acid không no mang một nối đôi ở vịtrí đối xứng nhau.
Phổ1
H-NMR chỉ ra sự có mặt của một nhóm metylcacbinol [H 4,28/4,30 (2H) và C 62,12] và một nhóm metincacbinol [H 5,25 (1H)/ C 68,91].
Hình 3.5. Phổ1
Hình 3.6. Phổ13
C-NMR và phổ DEPT của hợp chất SD3
Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất SD3
Hình 3.9. Phổ HMQC của hợp chất SD13
Các giá trị phổ thu nhận đƣợc so với tài liệu tham khảo khẳng định chất SD3
đƣợc xác định là một triglyceride có một nối đôi có công thức:
O O O C18H37 C19H39 C19H39 1 1'' 2 1' 3 CO CO CO
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập đƣợc 3 hợp chất lipid từ loài sao biển Anthenea aspera.
2. Cấu trúc của các hợp chất này đƣợc xác định nhờ vào các phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), hai chiều (COSY, HSQC, HMBC).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. http://www.wildsingapore.com/wildfacts/echinodermata/asteroidea/anthenea.htm [2]. Chong Jiang, kennet G.Boyd, Andrew Mearns spragg- Two Diketopiperazines
and One Halogenated Phenol from Cultures of the Marine Bacterium Pseudoalteromonas luteoviolacea, Natural Product Letters, (2000), 14 (6) 435- 440 [3]. https://fr.wikipedia.org/wiki/Lipide [4].https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad =rja&uact=8&ved=0ahUKEwisga3XsP_aAhVY57wKHXC5CT8QFggmMAA &url=https%3A%2F%2Fwww.khanacademy.org%2Fscience%2Fbiology%2Fm acromolecules%2Flipids%2Fa%2Flipids&usg=AOvVaw3pSQyiAgfwunReOZx dQmnD [5]. https://biology.tutorvista.com/biomolecules/lipids.html
[6]. GS.TS Phạm Quốc Long, “Các hợp chất Steroid glycoside mới từ hai loài sao biển Việt Nam Acanthater planci và Echinaster luzonicus”.
[7]. Dong G, Xu T, Yang B, Lin X, Zhou X, Yang X, Liu Y, “Chemical constituents and bioactivities of starfish.”, Chem Biodivers.2011; 8 :740-91. [8]. Pizza, C et al., Gazz. Chim. Ital., 1985, 115, 585
[9]. Kicha, A.A. et al, Khim. Prir. Soedin., 1985, 21, 801; Chem. Nat. Compd. (Engl. Transl.), 1985, 21, 760.
[10]. Iorizzi, M. et al., “Starfish saponins, part 23. steroidal glycosides from the starfish halltyle regularls”, J. Nat. Prod, 1986, 49, 67-78
[11]. Iorizzi, M. et al, “Starfish saponins, part 46. steroidal glycosides and polyhydroxysteroids from the starfish c ulcl ta nova eg uinea e”, J. Nat. Prod, 1991, 54, 1254-1264
[12]. Tang HF, Yi YH, Li L, Sun P, Zhang SQ, Zhao YP, “Three new asterosaponins from the starfish Culcita novaeguineaeand their bioactivity”,. Planta Medica, (2005), 71, 458-463.
[13]. Tang HF, Yi YH, Li L, Sun P, Zhang SQ, Zhao YP, “Asterosaponins from the starfish Culcita novaeguineae and their bioactivities”, (2006) Fitoterapia, 77, 28-34.
[14]. Tang HF, Cheng G, Wu J, Chen XL, Zhang SY, Wen AD, Lin HW ,“Cytotoxic asterosaponins capable of promoting polymerization of tubulin from the starfish Culcita novaeguineae.”, J Nat Prod. 2009,72, 284-9.
[15]. Trịnh Thị Thu Hƣơng, Nghiên cứu thành phần hóa học của loài sao biển Anthenea pentagonula, Luận văn thạc sỹ, 2007.
GS. TS Phạm Quốc Long Tạp chí KHCN ISSN : 0866. 708X, tập 48, số 4a, (2010) 39-44.
[16]. Ma N, Tang HF, Qiu F, Lin HW, Tian XR, Yao MN , “Polyhydroxysteroidal glycosides from the starfish Antheneachinensis.” , J Nat Prod. 2010 ;73 :590-7. [17]. Ngoan BT, Hanh TT, Vien le T, Diep CN, Thao NP, Thao do T, Thanh
NV, Cuong NX, Nam NH, Thung do C, Kiem PV, Kim YH, Minh CV, “Asterosaponins and glycosylated polyhydroxysteroids from the starfish Culcita novaeguineae and their cytotoxic activities.”, J Asian Nat Prod Res. 2015;17, 1010-7.
[18]. Malyarenko TV, Kharchenko SD, Kicha AA, Ivanchina NV, Dmitrenok PS, Chingizova EA, Pislyagin EA, Evtushenko EV, Antokhina TI, Minh CV, Stonik VA. “Anthenosides L-U, Steroidal Glycosides with Unusual Structural Features from the Starfish Anthenea aspera” J Nat Prod. 2016; 79, 3047-3056.
[19]. Kicha AA, Kalinovsky AI, Ivanchina NV, Malyarenko TV, Dmitrenok PS, Kuzmich AS, Sokolova EV, Stonik VA , “Furostane Series Asterosaponins and Other Unusual Steroid Oligoglycosides from the Tropical Starfish Pentacerasterregulus”, J Nat Prod. 2017; 80, 2761-2770.
[20]. Kicha AA, Ha DT, Ivanchina NV, Malyarenko TV, Kalinovsky AI, Dmitrenok PS, Ermakova SP, Malyarenko OS, Hung NA, Thuy TTT, Long PQ, “Six New
Polyhydroxysteroidal Glycosides, Anthenosides S1 - S6, from the Starfish Anthenea sibogae”, Chem Biodivers. 2018; 15:e1700553.
[21]. Ivanchina NV, Kicha AA, Malyarenko TV, Ermolaeva SD, Yurchenko EA, Pislyagin EA, Van Minh C, Dmitrenok PS, “Granulatosides D, E and other polar steroid compounds from the starfish Choriaster granulatus. Their immunomodulatory activity and cytotoxicity”, Nat Prod Res. 2018:1-8.
[22]. Kawano, Y. et al., “Isolation and Structure of Two New Ceramide Lactosides” Annalen, 1988, 19.
[23].https://books.google.com.vn/books?id=w1bLBQAAQBAJ&pg=PA7&lpg=PA7 &dq=Acanthacerebroside+C&source=bl&ots=q9tW_Ibnce&sig=raNhjgDHVch CikPfR4MwHYHavXI&hl=vi&sa=X&ved=0ahUKEwizxL6yif_aAhXLxrwKH Y_DDS4Q6AEIKzAB#v=onepage&q=Acanthacerebroside%20C&f=false [24]. Sugiyama, S. et al., “Synthesis of Acanthacerebroside A”, Annalen, 1988, 619;
1990-1063
[25]. Higuchi, R. et al., “Structures of Three New Cerebrosides, Astrocerebroside A, B, and C and of Related Nearly Homogeneous Cerebrosides”, Annalen, 1990, 51-55; 1996, 593-599
[26]. Kawatake S1, Nakamura K, Inagaki M, Higuchi R , “Isolation and structure determination of six glucocerebrosides from the starfish Luidia maculata”, Chem Pharm Bull (Tokyo). 2002, 50: 1091-6.
[27]. Maruta T1, Saito T, Inagaki M, Shibata O, Higuchi R , “Biologically active glycosides from Asteroidea, 41. Isolation and structure determination of glucocerebrosides from the starfish Linckia laevigata.”, Chem Pharm Bull (Tokyo). 2005; 53: 1255-8.
[28]. Inagaki M1, Ikeda Y, Kawatake S, Nakamura K, Tanaka M, Misawa E, Yamada M, Higuchi R, “Isolation and structure of four new ceramides from the starfish Luidia maculata.” Chem Pharm Bull (Tokyo). 2006; 54 : 1647-9.
[29]. Inagaki M, Nakata T, Higuchi R, “Isolation and structure of a galactocerebroside molecular species from the starfish Culcita novaeguineae”, Chem Pharm Bull (Tokyo). 2006; 54 : 260-1.
[30]. Pan K , Inagaki M , Ohno N , Tanaka C , Higuchi R , Miyamoto T , “Identification of sixteen new galactocerebrosides from the starfish Protoreaster nodosus.” Chem Pharm Bull (Tokyo). 2010, 58 : 470-4.