Trong quá trình nghiên cứu về sự hình thành và phát triển của ung thư, các nhà khoa học đã đồng ý rằng, sự sinh trưởng và phát triển của khối u là sự tác dụng cộng hưởng của nhiều yếu tố, nhiều gen. Trong đó BRAF hiện được coi như một trong những gen khởi phát và điều khiển quá trình này. Tầm quan trọng của đột biến BRAF được lần đầu công nhận vào năm 2002, cho đến thời điểm hiện tại, gần 40 loại đột biến đã được xác định[26][33]. Đột biến BRAF là nguyên nhân có 7% tổng số ung thư trên người, tùy loại ung thư mà đột biến BRAF xảy ra ở các vị trí khác nhau và mang những đặc trưng khác nhau. Tiêu biểu như đột biến BRAF V600E, V600K ở ung thư da melanoma (30-70%); BRAF V600E ở UTMBTG (36-83%), ung thư buồng trứng (39%), ung thư đại tràng (10%); BRAF V600E, G469A ở ung thư phổi không tế bào nhỏ (<5%)[49,50,65].
Gen BRAF nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 7 ở vị trí 34(7q34), gồm 18 exon với 190284 cặp basenitơ. Có 3 đồng phân Raf, bao gồm ARAF, BRAF, CRAF. Trong đó BRAF là thành phần hoạt động mạnh nhất và là đóng vai trò chính trong con được MAPK – một con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào cần thiết để duy trì các hoạt động của tế bào như phát triển, tăng sinh, biệt hóa, chết, đáp ứng với thụ thể ngoài màng tế bào. Con đường này dẫn truyền tín hiệu ngoài bào từ các yếu tố tăng trưởng, hormone, cytokine đến nhân thông qua một loạt các phản ứng dẫn truyền (Hình 1.4). Hoạt hóa Raf là một quá trình phức tạp diễn ra tại màng tế bào, nơi Raf trải qua quá trình phosphoryl hóa cũng như tương tác với các protein khác trước khi hoạt hóa. Sau khi RAS gắn GTP sẽ chuyển sang trạng thái hoạt hóa, gắn với vùng RBD trên protein BRAF để đưa BRAF về trạng thái hoạt hóa, và thực hiện các vai trò hoạt hóa các protein khác như: MEK, Cyclin D1, D2 và D3 (thúc đẩy phân bào), VEGF (sinh mạch), c-myc (mất nhạy cảm với các tín hiệu chống tăng trưởng), b3-integrin (xâm lấn và di căn) và mdm2 (tránh quá trình chết tế bào, tiềm năng nhân lên vô hạn và sự sinh mạch) [15].
20
Hình 1.8 Con đường tín hiệu MAPK. Ở tếbào bình thường, khi phối tử
gắn với Receptor Tyrosine kinase trên màng tế bào dẫn đến đồng phân hóa
receptor → phosphoryl hóa tựđộng tyrosine kinase bên trong màng tếbào →
hoạt hóa liên kết GTP- RAS → Phosphoryl hóa một loạt các gen BRAF, MEK,
ERK → dịch chuyển vào nhân → hoạt hóa các yếu tốphiên mã → biểu hiện gen
→ tăng trưởng, phân chia, biệt hóa tế bào.
Hơn 40 đột biến gen BRAF được xác định trên các khối u trên người, với ung thư tuyến giáp, BRAF V600E là đột biến quan trọng nhất vì nó liên quan đến quá trình làm mất ổn định trong các quá trình tăng trưởng, biệt hóa, tồn tại, tăng sinh, tính cố định của tế bào. Các đột biến khác đã được mô tả trong các nghiên cứu gần đây, tuy nhiên vai trò của chúng vẫn là vấn đề còn tranh cãi. Đột biến BRAF V600E xảy ra do sự thay thế T bằng A tại exon15, nucleotide 1799 trong gen ung thư dẫn đến sự thay đổi Valin (V) thành Acid glutamic (E) ở vị trí codon 600 trong protein. Điều này dẫn đến tăng hoạt tính của BRAF, kích hoạt con đường MAPK mà không cần các kích thích ngoại bào [43].
21
Hình 1.9 Con đường tín hiệu đột biến gen BRAF V600E trong ung thư tuyến
giáp. Thông thường, protein RAF là chất hiệu ứng và cũng là chất điều hòa ngược
âm tính của RAS (Trái). Tuy nhiên, trong ung thư tuyến giáp, đột biến BRAF V600E
sẽ kích hoạt con đường MAPK mà không phụ thuộc vào kích thích ngoại bào. Vì
vậy, không có điều hòa ngược âm tính nào ngăn cản, dẫn đến sự hoạt động mạnh mẽ của con đường này(Phải) [45]
Trong bệnh cảnh ung thư tuyến giáp, BRAF V600E gặp trong 36-83% tổng số ca bệnh, phổ biến hơn ở UTTG thể nhú, không và kém biệt hóa so với các thể khác như thể tủy hay thể nang. BRAF không chỉ đóng vai trò quan trọng trong sinh sản UTTG mà còn có vai trò thúc đẩy cho xâm nhập và tiến triển của khối u. Các nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy sự liên quan giữa đột biến và tiến triển bệnh trên lâm sàng [50].
Ở những bệnh nhân tái phát, di căn, việc điều trị chủ yếu sử dụng Iod phóng xạ (RAI). Tuy nhiên, đột biến BRAF có khả năng thay đổi nghiêm trọng quá trình hấp thụ và tích trữ Iod trong tế bào ung thư. Trong điều kiện sinh lý, Iod được vận chuyển vào tế bào tuyến giáp thông qua kênh đồng vận Na-I (NIS – Sodium Iodine Symporter), sau đó là vào nang giáp qua bơm Iod. Tại đây, Iod được tuyến giáp oxy hóa bằng TPO – Thyroid peoxydase và được kết hợp với Tg – thyroglobulin. Tuy nhiên với đột bến BRAF V600E, đột biến kiểm soát trực tiếp sự biểu hiện của gen NIS và một số gen khác liên quan đến quá trình chuyển hóa Iod, cụ thể là TPO, Tg, TSHR (thyroid stimulating receptor). Suy giảm chuyển hóa và hấp thu iod là nguyên nhân dẫn đến kháng trị Iod phóng xạ trên lâm sàng[4][50].
22
Giá trị của BRAF V600E trong chẩn đoán:
Ở người trưởng thành, bệnh lý nhân giáp rất phổ biến, có thể sờ thấy ở khoảng 5% dân số, trên 1/3 dân số có nhân giáp phát hiện trên siêu âm. Trong đó, có khoảng 5-8% nhân giáp có thể sờ thấy tiến triển thành ung thư hóa. Vì thế, mục tiêu hàng đầu trong đánh giá và theo dõi là loại trừ nhân ác tính. Hiện tại, sinh thiết tế bào bằng kim nhỏ để xác định tế bào học đang là xét nghiệm được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán để xác định nhân tuyến giáp là lành tính hay ác tính. Tuy nhiên, ít nhất 20% mẫu xét nghiệm không thể phân biệt một cách chắc chắn độ ác tính của nhân giáp. Bên cạnh đó, đột biến BRAF V600E thường không xuất hiện ở nhân giáp lành tính, nhưng lại trình diện thường xuyên ở ung thư tuyến giáp, đặc biệt với UTTG thể nhú, UTTG thể không biệt hóa hoặc kém biệt hóa tiến triển từ thể nhú [34].Theo Poller, đột biến BRAF V600E có độ đặc hiệu cho chẩn đoán lên tới 99% [37].Vì thế, một số trung tâm, bệnh viện trên thế giới sử dụng BRAF như một xét nghiệm thường quy để cải thiện chẩn đoán của FNAB trước phẫu thuật. Khuyến cáo của ATA năm 2009 đã đưa xét nghiệm gen BRAF khuyến cáo cho những trường hợp mô bệnh học chưa đưa ra được chẩn đoán chắc chắn [48] [7].
Giá trị của đột biến BRAF V600E trong tiên lượng bệnh:
Đóng vai trò quan trọng trong sản sinh ung thư tuyến giáp, việc xác định được đột biến gen BRAF là một yếu tố quan trọng để phân tầng nguy cơ, dự kiến tiên lượng và đưa ra phương pháp điều trị, theo dõi hợp lý. Đột biến BRAF được cho rằng là một yếu tố tiên lượng xấu đối với UTTG thể nhú, nó ảnh hưởng tiêu cực đến xâm lấn tổ chức xung quanh, tái phát tại chỗ, di căn hạch và di căn xa. Với UTTG thể nang hiện chưa có bằng chứng chứng minh sự liên quan giữa các đặc điểm bệnh lý này. Qua xét nghiệm tìm đột biến gen, có thể giúp các bác sỹ đưa ra những lựa chọn điều trị tốt hơn. Ví dụ trong phẫu thuật cắt bỏ tuyến giáp, lựa chọn giữa cắt bỏ 1 thùy hay toàn bộ tuyến giáp, có hay không kèm theo nạo vét hạch cổ [38]. Đột biến gen BRAF V600E đã và đang được nghiên cứu và đánh giá trong thất bại điều trị bằng Iod phóng xạ, vì thế, với chẩn đoán gen BRAF V600E sẽ tiên lượng được khả năng và lựa chọn phương pháp điều trị cho phù hợp. Hiện tại điều trị đích đã được FDA cho phép chỉ định cho những bệnh nhân UTTG thể biệt hóa, tái phát, di căn, thất bại điều trịvào năm 2013 [1].
1.2.2 Phương pháp phát hiện đột biến gen BRAF V600E
Xác định đột biến BRAF ngày càng được thực hiện nhiều trên thực hành lâm sàng. Các phương pháp này đều dựa trên phát hiện DNA từ mô bệnh học, sau
23
khi được cố định trong Formalin – vùi parafin. Các phương pháp khác nhau có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau.
Hiện tại, tại bệnh viện Bạch Mai, sau khi mô bệnh được lấy nhờ phẫu thuật hoặc chọc hút tế bào bằng kim nhỏ, sẽđược cốđịnh trong Fomalin – vùi Parafin sau đó được tách DNA, định lượng DNA. Sau đó được xét nghiệm phát hiện đột biến qua một trong hai phương pháp: PCR – lai đầu dò (Theo kit StripAssay ® ViennaLab) hoặc Real – time PCR (Theo kit cobas ® 4800 BRAF V600 Mutation Test - Roche)
Phương pháp Real-time PCR – Khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase theo thời gian thực: Ứng dụng công nghệ Real – time PCR cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại của gen sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kit Cobas ® 4800 BRAF V600 Mutation Test phát hiện đột biến gen BRAF ở codon 600, đột biến V600E và một số đột biến không phải V600E (V600D, V600E2 và V600K), đại diện cho khoảng 90% của tất cả các đột biến BRAF tìm thấy trong khối u ác tính.
Phương pháp PCR – lai đầu dò: giai đoạn PCR sử dụng đoạn mồi đặc hiệu giúp khuếch tán chính xác trình tự gen quan tâm. Phân tử biotin gắn trên mồi được đưa vào sản phẩm khuếch đại. Sử dụng các đầu dò có sẵn đề kết hợp chính xác với sản phẩm khuếch đại, từ đó xác định được gen đột biến. kit StripAssay ® ViennaLab.
1.3 Một số nghiên cứu về mối liên quan giữa đột biến BRAF V600E với UTTG trong và ngoài nước trong và ngoài nước
1.3.1 Trên thế giới:
Với tỷ lệ mắc cao, ung thư tuyến giáp đã và đang là đề tài được nhiều tác giả nghiên cứu. Một nghiên cứu của Park và cộng sự (2014) tại Hàn Quốc, cho thấy 69,2% bệnh nhân có BRAF V600E. Các số liệu thống kê cho thấy mối liên quan giữa đột biến BRAF V600E với các đặc điểm tiên lượng xấu như: giới tính, số lượng u, xâm lấn ngoại giáp, mức độ tiến triển của khối u (T-stage) và di căn hạch với p<0,05 [36].
Huang và cộng sự (2018) nghiên cứu trên 2490 bệnh nhân UTTG, đã thống kê, có 81,3% bệnh nhân mang đột biến BRAF V600E. So sánh giữa hai nhóm có và không mang đột biến, có thể thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở các đặc điểm vị trí khối u (khu trú ở một thùy hay hai thùy), số lượng u, giải phẫu bệnh. Về di căn hạch cũng nhận thấy mối liên quan với p<0,001 [52].
24
Celik và cộng sự (2020) nghiên cứu trên bệnh án của các bệnh nhân UTTG từ 2007-2017, lại cho kết quả không giống với các nghiên cứu trên. Tác giả chứng minh không có mối liên quan giữa đột biến BRAF V600E với giới tính, độ tuổi, số lượng u và di căn xa (p>0,05). Tuy nhiên vẫn có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa đột biến BRAF V600E với xâm lấn ngoại giáp, di căn hạch và di căn xa [23].
1.3.2 Tại Việt Nam
Hiện này, có một số ít nghiên cứu về đặc điểm đột biến gen BRAF V600E với các đặc điểm lâm sàng, điển hình như nghiên cứu của Mai Trọng Khoa và cộng sự (2018); Nghiên cứu của Ngô Thị Minh Hạnh và cộng sự (2020).
Mai Trọng Khoa và cộng sự (2018), nghiên cứu trên 187 bệnh nhân tại bệnh viện Bạch Mai, cho thấy tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E là 78,2%. So sánh mối liên quan các đặc điểm lâm sàng và đột biến, không thấy mối liên quan giữa BRAF V600E với giới tính, độ tuổi, mô bệnh học, độ tiến triển khối u hay di căn hạch. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm có và không mang đột biến được ghi nhận khi so sánh yếu tố di căn xa [5].
Tác giả Ngô Thị Minh Hạnh (2020) thống kê có 70,2% bệnh nhân mang đột biến. Không có sự khác biệt về tuổi và giới, cũng như các đặc điểm di căn hạch, giai đoạn bệnh. Nhận thấy có mối liên quan giữa BRAF V600E với giai đoạn tiến triển khối u [7].
Cùng với sự hiểu biết về đột biến BRAF V600E, mối liên quan giữa đột biến và các đặc điểm lâm sàng trên UTTG đã được thế giới quan tâm và nghiên cứu trong hai thập kỷ vừa qua. Đã có nhiều tác giả thực hiện nghiên cứu trên bệnh nhân UTTG và mối liên quan giữa đột biến gen BRAF V600E với các đặc điểm lâm sàng, tuy nhiên đối tượng nghiên cứu thường là toàn bộ bệnh nhân mắc UTTG hoặc khu trú ở nhóm bệnh nhân có mô bệnh học là UTBMTG thể nhú, ít nghiên cứu đề cập đến mối liên quan này trên bệnh nhân trẻ (dưới 45 tuổi) – đối tượng được cho là có tiên lượng tốt hơn. Vì thế, để góp phần làm rõ những vấn đề chưa sáng tỏ, chúng tôi tiến hành đề tài này.
25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Là bệnh nhân dưới 45 tuổi, được chẩn đoán ung thư tuyến giáp tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu- Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2020- 9/2020.
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:
- Tất cả các bệnh nhân UTTG dưới 45 tuổi
- Bệnh nhân được thực hiện phẫu thuật cắt tuyến giáp
- Bệnh nhân được chẩn đoán UTTG dựa vào kết quả mô bệnh học
- Bệnh nhân được làm xét nghiệm sinh học phân tử đột biến gen BRAF V600E.
- Bệnh nhân có đầy đủ hồ sơ bệnh án lưu trữ bao gồm thông tin hành chính, triệu chứng lâm sàng, giai đoạn bệnh, kết quả mô bệnh học,…
- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ
- UTTG thứ phát từ cơ quan khác.
- Hồ sơ bệnh án không đủ thông tin phục vụ nghiên cứu
2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.2.2 Cỡ mẫu:
Cỡ mẫu thuận tiện
2.2.3 Quy trình tiến hành:
Lựa chọn bệnh nhân được chẩn đoán xác định là ung thư tuyến giáp dưới 45 tuổi, được tiến hành làm xét nghiệm đột biến gen BRAF tại Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai.
Thu thập thông tin theo bệnh án nghiên cứu: thông tin hành chính, đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm gen.
Nhập số liệu và xử lý số liệu bằng SPSS 25.0
2.2.4 Nội dung nghiên cứu.
Thông tin hành chính: tuổi, giới tính
Lâm sàng: Triệu chứng cơ năng,vị trí u, di căn hạch hay di căn xa.
Cận lâm sàng: Mô bệnh học, đặc điểm khối u, kích thước, số lượng u, xâm lấn bao giáp, vị trí khối u, vị trí di căn hạch, vị trí, phương pháp lấy mẫu.
26
Phương pháp phẫu thuật, kết quả xạ hình giáp sau phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, điều trị đích, điều trị hormon, điều trị Iod phóng xạ (liều, số lần)
Khảo sát tình trạng đột biến gen BRAF V600E và một số yếu tố liên quan: tuổi, giới, thể, mô bệnh học, vị trí u –hạch, tình trạng di căn,..
2.2.5 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1 năm 2020 đến tháng 9 năm 2020
2.2.6 Địa điểm nghiên cứu
Đơn vị Gen- Tế bào gốc, Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai.
2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được làm sạch trước khi được nhập trên phần mềm ….
Số liệu được mã hóa, chỉ thành viên trực tiếp nghiên cứu được quyền tiếp cận số liệu.
Dữ liệu được phân tích trên phần mềm thống kê SPSS với các test thống kê y học.
Mô tả số liệu: sử dụng thuật toán thống kê mô tả, các số liệu trình bày theo bảng biểu số liệu và các biểu đồ.
Kiểm định χ2 để xác định sự khác nhau khi so sánh tỉ lệ giữa các biến số có từ 2 nhóm trở lên. Sự so sánh có ý nghĩa thống kê với p <0,05.
Sử dụng kiểm định Fisher để xác định sự khác nhau khi so sánh các biến số có từ 2 nhóm trở lên không thỏa mãn kiểm định χ2. Sự so sánh có ý nghĩa thống kê với p <0,05.
2.4 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
Đây là một nghiên cứu mô tả, chỉ sử dụng số liệu trên hồ sơ bệnh án, không can thiệp trực tiếp vào đối tượng vì vậy không ảnh hưởng đến sức khoẻ bệnh