và tăng trƣởng chồi bên in vitro:
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của BA và NAA, BA và Kn lên sự tạo chồi in vitro cây hoa cúc Chrysanthemum sp. Chỉ tiêu BA 0.3 mg/l NAA 0.2 mg/l Kn 0.1 mg/l Tỷ lệ chồi phát sinh 73.7 % 87.5 %
Chiều cao chồi (cm)
2.5±0.34 1.8 ± 0.13
Số đốt/1 chồi 3.0 ± 1.0 3.0 ± 1.0
Ký hiệu:
(1): Mơi trường bổ sung BA 0.3 mg/l và NAA 0.2 mg/l. (2): Mơi trường bổ sung BA 0.3 mg/l và Kn 0.1 mg/l.
Trên mơi trường bổ sung BA 0.3 mg/l kết hợp với NAA 0.2 mg/l, và BA 0.3 mg/l kết hợp với Kn 0.1 mg/l, sự tạo chồi từ mẫu cấy cĩ thể quan sát được sau 6 ngày (đối với chồi ngọn ở mơi trường cĩ bổ sung thêm NAA) đến 7 ngày (đối với đốt thân ở mơi trường cĩ bổ sung NAA và các mẫu cấy trên mơi trường cĩ bổ sung Kn).
Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi ở mơi trường (2) cao hơn so với mơi trường (1). Tuy nhiên mơi trường (1) cĩ hiệu quả cao hơn mơi trường (2) về chiều cao chồi và số lượng đốt/chồi (bảng 4.3).
Nhìn chung chồi khơng phát triển tốt về chiều cao, ít rễ, rễ ngắn, mỗi chồi cĩ từ 5–8 lá, thân ốm, cứng, ở một số trường hợp thân cĩ màu đỏ nâu, thân bị cong ở các đốt cuối gần gốc, khoảng cách giữa các đốt thân ngắn 0.3–0.5 cm ở mơi trường (2), 0.4–0.9 cm ở mơi trường (1) (hình 4.3; hình 4.4).
36
Ảnh 4.4: Cây in vitro sau 3 tuần cấy trên mơi trường MS bổ sung BA + Kn
37
4.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng của tuổi sinh lý của vật liệu nuơi cấy trên sự hình thành và tăng trƣởng chồi bên in vitro: hình thành và tăng trƣởng chồi bên in vitro:
a) Trên mơi trƣờng bổ sung BA 0.3 mg/l:
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tuổi sinh lý đến sự hình thành và tăng trưởng của chồi trên mơi trường cĩ BA 0.3 mg/l
Chỉ tiêu Mơi trường MS cĩ bổ sung BA 0.3mg/l
Chồi ngọn Đốt 2-3 Đốt 4-5
Tỷ lệ chồi phát sinh 100% 100% 100%
Chiều cao chồi (cm) 4.1 ± 0.17 3.8 ± 0.12 3.6 ± 0.18
Số đốt/1 chồi 4.7 ± 1.0 4.0 ± 1.0 4.6 ± 1.0
Khoảng cách giữa các đốt thân (cm)
0.8 – 1.5 0.6 – 1.5 0.7 – 1.3
Hình thái chồi Thân to,chắc, thẳng, 7-9 lá, nhiều rễ
Thân to, thẳng, 6-9 lá, nhiều rễ
Thân to, chắc, 6-9 lá, nhiều rễ
Trên mơi trường cĩ bổ sung BA 0.3 mg/l, mẫu cấy từ chồi ngọn tăng trưởng sau 4 ngày, sự phát sinh chồi cũng cĩ thể quan sát được sau 5 ngày ở các mẫu cấy từ các đốt 2, 3, 4, 5. Sự tăng trưởng của chồi ngọn tốt hơn so với các chồi từ đốt thân biểu hiện qua chiều cao chồi và số đốt trung bình trên một chồi (bảng 4.4).
Chồi hình thành từ các đốt 2, 3, 4 và 5 phát triển tốt cĩ từ 6 – 9 lá, rễ nhiều và dài, thân mọc thẳng, cao và khỏe, mỗi chồi cĩ từ 3 đến 6 đốt, khoảng cách giữa các đốt từ 0.6 – 1.5 cm (hình 4.6)
38
a) b) c) Ảnh 4.6: Cây 3 tuần tuổi cĩ nguồn gốc từ:
a) đốt 4-5. b) đốt 2-3. c) chồi ngọn.
b) Trên mơi trƣờng bổ sung BA 0.5 mg/l:
Trên mơi trường cĩ bổ sung BA 0.5 mg/l, mẫu cấy từ chồi ngọn tăng trưởng sau 4 ngày, sự phát sinh chồi cũng cĩ thể quan sát được sau 5 ngày nuơi cấy ở các mẫu cấy từ các đốt thân 2, 3, 4, 5. Sự hình thành và tăng trưởng của chồi từ đốt 2-3 cao hơn so với các mẫu cấy từ chồi ngọn và các đốt 4-5 biểu hiện qua chiều cao chồi và số đốt trung bình trên một chồi (bảng 4.5). Tuy nhiên sự khác nhau về chiều cao chồi giữa các mẫu cấy từ chồi ngọn và từ các đốt 2, 3, 4 và 5 khơng đáng kể.
Mẫu cấy từ chồi ngọn và đốt 2-3 cĩ sự chênh lệch lớn về chiều cao so với đốt 4-5 (chiều cao trung bình của chồi ngọn là 3.4, đốt 2-3 là 3.6 cm và đốt 4-5 là 2.3 cm), số đốt/1 chồi khơng cĩ sự khác nhau nhiều nhưng khoảng cách giữa các đốt ở chồi từ đốt 4-5 ngắn hơn, mỗi chồi cĩ từ 5 – 9 lá, rễ ngắn và ít (bảng 4.5) (hình 4.7).
39
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tuổi sinh lý đến sự hình thành và tăng trưởng của chồi trên mơi trường cĩ BA 0.5 mg/l:
Chỉ tiêu Mơi trường MS cĩ bổ sung BA 0.5mg/l
Chồi ngọn Đốt 2-3 Đốt 4-5
Tỷ lệ chồi phát sinh 100% 100% 100%
Chiều cao chồi (cm) 3.4 ± 0.09 3.6 ± 0.16 2.3 ± 0.12
Số đốt/1 chồi 3.0 ± 1.0 4.0 ± 1.0 3.0 ± 1.0
Khoảng cách giữa các
đốt thân (cm) 0.7 -1.3 0.6 – 1.2 0.4 – 1.1
Hình thái chồi Thân mập, xốp, 5- 8 lá, ít rễ Thân vừa, thẳng, 6-9 lá, ít rễ Thân vừa, thẳng, 5-8 lá, ít rễ a) b) c)
Ảnh 4.7: Cây 3 tuần cĩ nguồn gốc từ: a) chồi ngọn.
b) đốt 2-3. c) đốt 4-5.
40
c) Trên mơi trƣờng bổ sung BA 1.0 mg/l:
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tuổi sinh lý đến sự hình thành và tăng trưởng của chồi trên mơi trường cĩ BA 1.0 mg/l:
Chỉ tiêu Mơi trường MS cĩ bổ sung BA 1.0 mg/l
Chồi ngọn Đốt 2-3 Đốt 4-5
Tỷ lệ chồi phát sinh 100% 100% 100%
Chiều cao chồi (cm) 3.4 ± 0.18 3.2 ± 0.09 3.1 ± 0.12
Số đốt/1 chồi 4.0 ± 1.0 4.0 ± 1.0 4.0 ± 1.0
Khoảng cách giữa các
đốt thân (cm) 0.7 – 1.3 0.6 – 0.9 0.4 – 1.6
Hình thái chồi Thân ốm, một số chồi bị đỏ nâu ở gốc (đốt 4 - 5), lá nhỏ, 6-9 lá, rễ ngắn và rất ít
Ảnh4.8: Cây 3 tuần cĩ nguồn gốc từ: a) chồi ngọn.
b) đốt 2-3. c) đốt 4-5.
41
Trên mơi trường cĩ bổ sung BA 1.0 mg/l sự hình thành và tăng trưởng của chồi từ chồi ngọn và từ các đốt thân tương tự nhau (bảng 4.6). Chồi xuất phát từ đốt thân thứ 4 và thứ 5 cĩ màu đỏ nâu, rễ ngắn và ít ( ảnh 4.8)
Như vậy, từ các kết quả ở bảng 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tơi rút ra kết luận rằng chồi ngọn của cây hoa cúc in vitro tăng trưởng tốt nhất trên mơi trường bổ sung BA 0.3 mg/l.
4.1.5 Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết tảo Spirulina tác dụng lên sự phát triển của chồi bên in vitro: phát triển của chồi bên in vitro:
Tỷ lệ tạo chồi từ mẫu cấy vào các mơi trường bổ sung BA 0.3 mg/l và dịch chiết tảo các nồng độ khác nhau là 100%.
4.1.5.1 Phá vỡ tế bào tảo bằng sĩng siêu âm:
Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo Spirulina (tế bào tảo được phá vỡ bằng sĩng siêu âm trong 5 phút và 6 phút) với nồng độ 10% cĩ hiệu quả hơn trong sự tăng trưởng chồi thể hiện qua chiều cao và số đốt/chồi, nồng độ dịch chiết tảo càng cao chiều cao và số đốt/chồi càng giảm (bảng 4.7) (bảng 4.8).
Bảng 4.7: Ảnh hưởng của dịch chiết tảo lên sự hình thành và tăng trưởng chồi
Chrysanthemum sp.
Chỉ tiêu
Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo Spirulina
(phá vỡ tế bào trong 5‟) Mơi trường đối chứng (MS cĩ BA 0.3 mg/l)
(1) (2) (3)
Tỷ lệ chồi phát
sinh 100% 100% 100% 100%
Chiều cao chồi
(cm) 2.9 ± 0.14 2.5 ± 0.17 2.4 ± 0.16 3.4 ± 0.12 Số đốt/1 chồi 3.8 ± 1.3 3.6 ± 1.3 3.4 ± 1.3 - Khoảng cách giữa các đốt thân (cm) 0.5 – 0.9 0.3 – 0.6 0.4 – 0.7 - Đường kính thân (cm) 1.23 ± 0.13 1.11 ± 0.14 1.02 ± 0.18 0.94 ± 0.09
42
(3) (2) (1) Ảnh 4.9: Cây sau 3 tuần cấy vào mơi trường bổ sung dịch tảo.
(1): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 10%. (2): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 15%. (3): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 20%.
Chồi tạo thành cĩ chiều cao thấp, thân thẳng, mập nhưng xốp và dễ gãy, thân chuyển sang đỏ nâu khi thời gian nuơi cấy kéo dài. Khoảng cách giữa các đốt ngắn, đường kính thân to nhất khoảng 1.31 ± 0.11 cm, nhỏ nhất khoảng 0.94 ± 0.18 cm (bảng 4.7) (bảng 4.8), mỗi chồi cĩ từ 6-9 lá, lá nhỏ thường mọc đối, khơng tạo rễ, cĩ hiện tượng tạo sẹo ở gốc chồi (ảnh 4.9) (ảnh 4.10).
Chiều cao trung bình của chồi phát sinh từ các mẫu cấy trên mơi trường đối chứng là mơi trường MS bổ sung BA 0.3 mg/l lại cho hiệu quả cao hơn về sự tăng trưởng chiều cao chồi. Sự chênh lệch về số lượng đốt/chồi, số lá là khơng đáng kể. Rễ mọc từ chồi trên mơi trường đối chứng dài và nhiều trong khi chồi trên mơi trường bổ sung dịch chiết tảo khơng tạo rễ. Tuy nhiên, chồi tăng trưởng trên mơi trường cĩ bổ sung dịch tảo lại cĩ hiệu quả tốt hơn trong việc tăng đường kính thân (bảng 4.7, 4.8, 4.9).
43
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của dịch chiết tảo lên sự hình thành và tăng trưởng chồi
Chrysanthemum sp.
Chỉ tiêu
Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo
Spirulina
(phá vỡ tế bào trong 6‟) Mơi trường đối chứng (MS cĩ BA 0.3 mg/l)
(1) (2) (3)
Tỷ lệ chồi phát
sinh 100% 100% 100% 100%
Chiều cao chồi
(cm) 2.7 ± 0.21 2.5 ± 0.16 2.5 ± 0.18 3.4 ± 0.12 Số đốt/1 chồi 3.6 ± 1.3 3.3 ± 1.4 3.5 ± 1.4 - Khoảng cách giữa các đốt thân (cm) 0.5 – 0.9 0.3 – 0.6 0.4 – 0.7 - Đường kính thân (cm) 1.31 ± 0.11 1.24 ± 0.12 1.29 ± 0.09 0.94 ± 0.09 (1) (2) (3) Ảnh 4.10: Cây sau 3 tuần cấy vào mơi trường bổ sung dịch tảo.
(1): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 10%. (2): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 15%. (3): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 20%.
44
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của dịch chiết tảo lên sự hình thành và tăng trưởng chồi
Chrysanthemum sp.
Chỉ tiêu
Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo
Spirulina
(phá vỡ tế bào trong 7‟) Mơi trường đối chứng (MS cĩ BA 0.3 mg/l)
(1) (2) (3)
Tỷ lệ chồi phát
sinh 100% 100% 100% 100%
Chiều cao chồi
(cm) 3.2 ± 0.23 3.4 ± 0.17 2.9 ± 0.18 3.4 ± 0.12 Số đốt/1 chồi 4.1 ± 1.3 3.2 ± 1.1 3.3 ± 1.4 - Khoảng cách giữa các đốt thân (cm) 0.6 – 0.9 0.5 – 1.1 0.4 – 0.8 - Đường kính thân (cm) 1.34 ± 0.13 1.18 ± 0.11 1.24 ± 0.13 0.94 ± 0.09 Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo Spirulina (tế bào tảo được phá vỡ bằng sĩng siêu âm trong 7 phút) với tỷ lệ 15% so với mơi trường cĩ hiệu quả hơn trong sự tăng trưởng chồi so với các tỷ lệ cịn lại biểu hiện qua chiều cao và số đốt/chồi (bảng 4.9).
Sự chênh lệch về chiều cao chồi khơng đáng kể ở mơi trường (1) và (2), chồi cĩ chiều cao thấp nhất ở mơi trường (3). Tuy chồi tạo thành ở mơi trường (2) cĩ chiều cao tốt hơn nhưng ở mơi trường (1) số đốt/chồi và đường kính thân chồi lại cao hơn (Bảng 4.10). Khoảng cách giữa các đốt ngắn, mỗi chồi cĩ từ 5 – 9 lá, ở mơi trường (1) cĩ hiện tượng thân bị hĩa nâu đỏ ở gốc chồi, thân mập, thẳng nhưng xốp và dễ gãy, ko tạo rễ, cĩ hiện tượng tạo sẹo ở gốc chồi (ảnh 4.11).
45
Ảnh 4.11: Cây sau 3 tuần cấy vào mơi trường bổ sung dịch tảo. (1): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 10%. (2): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 15%. (3): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 20%.
4.1.5.2 Phá vỡ tế bào tảo bằng enzyme Viscozyme:
Chồi cĩ chiều cao thấp, mơi trường bổ sung 10% dịch tảo cho hiệu quả tốt hơn về chiều cao chồi và đường kính thân, chồi cao nhất đạt 2.8 cm (ảnh 4.12), đường kính thân vào khoảng 1.13 ± 0.07 (bảng 4.10), khoảng cách giữa các đốt thân ngắn, khoảng cách ngắn nhất giữa các đốt là 0.2 cm, cao nhất vào khoảng 0.6 cm; thân mập nhưng mọng nước và dễ gãy, mỗi chồi cĩ từ 5 -9 lá, chồi khơng tạo rễ, khoảng cách giữa các đốt ngắn, cĩ hiện tượng tạo sẹo ở gốc chồi (ảnh 4.12).
(1) (2)
(2) (3)
46
Bảng 4.10: Ảnh hưởng của dịch chiết tảo lên sự hình thành và tăng trưởng chồi
Chrysanthemum sp.
Chỉ tiêu
Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo
Spirulina Mơi trường đối chứng (MS cĩ BA 0.3 mg/l)
(1) (2) (3)
Tỷ lệ chồi phát
sinh 100% 100% 100% 3.4 ± 0.12
Chiều cao chồi
(cm) 2.7 ± 0.14 2.4 ± 0.17 2.5 ± 0.18 - Số đốt/1 chồi 4.3 ± 1.2 4.3 ± 1.4 4.2 ± 1.2 - Khoảng cách giữa các đốt thân (cm) 0.3 – 0.6 0.3 – 0.5 0.2 – 0.5 0.94 ± 0.09 Đường kính thân (cm) 1.04 ± 0.13 0.95 ± 0.09 1.13 ± 0.07 3.4 ± 0.12
Ảnh 4.12: Cây sau 3 tuần cấy vào mơi trường bổ sung dịch tảo. (1): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 10%. (2): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 15%. (3): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 20%.
47
4.1.5.3 Phá vỡ tế bào tảo bằng phƣơng pháp shock nhiệt:
Bảng 4.11: Ảnh hưởng của dịch chiết tảo lên sự hình thành và tăng trưởng chồi
Chrysanthemum sp.
Chỉ tiêu Mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo Spirulina Mơi trường đối chứng (MS cĩ BA 0.3 mg/l)
(1) (2) (3)
Tỷ lệ chồi phát
sinh 100% 100% 100% 100%
Chiều cao chồi
(cm) 2.3± 0.12 2.1 ± 0.17 2.8 ± 0.18 3.4 ± 0.12 Số đốt/1 chồi 3.7 ± 1.6 3.7 ± 1.3 4.1 ± 1.3 - Khoảng cách giữa các đốt thân (cm) 0.2 – 0.7 0.3 – 0.7 0.5 – 0.9 - Đường kính thân (cm) 1.12 ± 0.24 1.13 ± 0.08 1.24 ± 0.16 0.94 ± 0.09 Chồi cĩ chiều cao thấp, mơi trường bổ sung 20% dịch tảo cho hiệu quả tốt về chiều cao, đường kính thân và số đốt/ chồi, chồi cao nhất đạt 2.8 cm (ảnh 3.13), đường kính thân 1.24 ± 0.16 (bảng 4.11), khoảng cách giữa các đốt ngắn, thân mập nhưng mọng nước và dễ gãy, lá nhỏ, khơng tạo rễ, khoảng cách giữa các đốt ngắn, cĩ hiện tượng tạo sẹo ở mẫu cấy vào từ cây mẹ (ảnh 4.13).
Trong cả 2 trường hợp khảo sát sự hình thành và tăng trưởng của chồi – dịch chiết tảo thu được bằng phương pháp shock nhiệt và phương pháp sử dụng Vyscozyme – khi so sánh với chồi phát sinh từ mơi trường nuơi cấy đối chứng (mơi trường MS cĩ bổ sung BA 0.3 mg/l), mơi trường cĩ bổ sung dịch tảo khơng cĩ được hiệu quả tốt đối với sự tăng trưởng chiều cao, ra rễ ở chồi, tuy nhiên chồi trong mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo lại cho hiệu quả tốt hơn đối với sự tăng trưởng của đường kính thân chồi (bảng 4.10, 4.11).
48
(1) (2) (3) Ảnh 4.13: Cây sau 3 tuần cấy vào mơi trường bổ sung dịch tảo.
(1): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 10%. (2): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 15%. (3): Mơi trường bổ sung dịch chiết tảo tỷ lệ 20%.
Ảnh 4.14: So sánh giữa lá ở đốt 4 -5 trong mơi trường dịch tảo và lá bình thường. Lá (2) ở vị trí đốt 4 – 5 trên mẫu cấy trong mơi trường cĩ bổ sung dịch chiết tảo, lá mọng nước, đường kính 0.3 cm, phiến lá hẹp khơng cĩ răng cưa, dày hơn so với lá cùng vị trí trên đốt thân (lá (1)) và lá ở ngọn (lá 3) (ảnh 4.14).
49