Sự khử cation Ag+ thành Ag0 bằng NaBH4

NaBH4 được đưa vào dung dịch Ag⁺_PEG_MMT với tỷ lệ mol giữa NaBH4/Ag⁺ = 2 lần. Sự khử Ag⁺ được tiến hành trong thời gian 1h30’.

Bếp khuấy từ

Che sáng bằng nylon đen Sục khí N2

29

Sau đó, tiến hành ly tâm, lọc rửa để loại hết các cation Ag+

hoặc Ag⁰ còn ở bên ngoài MMT (kiểm tra sự tồn tại Ag+

trong dung dịch lọc bằng NaCl, nếu còn Ag⁺ thì sẽ cho kết tủa trắng AgCl), sấy ở 80⁰C cho đến khi trọng lượng không đổi, sản phẩm thu được tiếp tục qua quá trình nghiền mịn, sấy lại một lần nữa, kết quả thu được cuối cùng là Nano bạc được tổng hợp trong giá mang MMT với chất bảo vệ PEG hay một Nano composite Ag_PEG_MMT.

Kết quả được khảo sát và kiểm nghiệm bằng UV-VIS để theo dõi sự hình thành nano bạc ở các điều kiện khác nhau. Giản đồ XRD minh chứng cho sự có mặt của bạc và TEM xác định sự hình thành nano bạc trên MMT, cũng như cho thấy kích thước và sự phân bố của nano bạc khi hấp phụ vào MMT.

Hình 13. Sản phẩm Ag_PEG_MMT

2.2.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch keo Nano bạc [21, 22]

Chủng E. Coli do Phòng Thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp.

2.2.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch Nano bạc

Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia và tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.. Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng sau khi đã nuôi cấy ở 37^oC trong 24-48 giờ. Từ đó tính mật độ tế bào và hiệu suất kháng khuẩn theo công thức (*) và (**).

2.2.4.2 Phương pháp tiến hành

Tạo môi trường Nutrient Agar cho vi khuẩn:

Thành phần dung dịch nuôi: Pepton : 5g

30

Yeast extract: 5g Beef extract: 5g

Nước (khử trùng) : 1 lít Agar (2%)

Các thành phần được trộn đều, hấp khử trùng, sau đó rót lên các đĩa petri đã chuẩn bi sẳn, đem lưu giử trong môi trường khử trùng, nhiệt độ thích hợp.

Cấy khuẩn E.coli:

Chuẩn bị 6 ống nghiệm chứa 9ml nước cất (đã được tiệt trùng). Nhỏ 1ml dịch vi khuẩn E.coli vào ống nghiệm thứ 1, ta được dịch khuẩn với nồng độ pha loãng 10^-1 , tiếp tục lắc đều ống thứ I trong vài phút, lấy 1ml từ ống thứ nhất, nhỏ vào ống thứ II , ta được dịch khuẩn E.coli với độ pha loãng 10-2

, làm tương tự ta sẽ có dịch khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau từ 10-1

đến 10^-6, đây sẽ là mẫu đối chứng.

Làm tương tự như trên, nhưng ở hai ống nghiệm thứ 4 và 6 chứa dd MMT_PEG_Ag (nồng độ Ag vào khoảng 10 ppm)

Sau 10 phút, từ mỗi hai nồng độ 10-4

và 10^-6 của dịch vi khuẩn từ ống thí nghiệm và ống đối chứng lấy ra 100μl đem trải lên đĩa môi trường Nutrient Agar. Lấy thêm 100 μl từ 2 ống đối chứng trải lên 2 đĩa môi trường, sau đó nhỏ vào mỗi đĩa một giọt dung dịch Ag_PEG_MMT. Đem tất cả ủ ở 37⁰C trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được.

Cách tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa. Dùng những đĩa có số khuẩn lạc từ 25-300 (theo FDA) để tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu. Mật độ tế bào vi sinh vật được tính theo công thức sau:

Trong đó

Mi: mật độ tế bào trong mẫu ban đầu Ai : số khuẩn lạc trung bình trong đĩa Di : là độ pha loãng

V : là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)

Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.

Hiệu suất kháng khuẩn được xác định theo công thức sau

31

Η : hiệu suất kháng khuẩn

N1 là số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng N2 là số khuẩn lạc trong đĩa chứa Nano bạc

2.3 Phân tích mẫu:

2.3.1 Sơ đồ thực nghiệm và phân tích mẫu

2.3.2 Phổ tử ngoại và phổ khả kiến (UV-VIS)

Phổ tử ngoại và khả kiến, viết tắt là UV-VIS (Ultraviolet- Visible) là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi từ lâu.

MMT

Ag

_MMT

Ag

_PEG_MMT

Ag_PEG_MMT

Kiểm tra khả năng diệt khuẩn E.coli của mẫu

Nhận xét

XRD : khảo sát độ rộng khoang sét

32

Phổ tử ngoại và khả kiến của các hợp chất hữu cơ gắn liền với bước chuyển electron giữa các mức năng lượng electron trong phân tử khi các electron chuyển từ các obitan liên kết hoặc không liên kết lên các obitan phản liên kết có mức năng lượng cao hơn, đòi hỏi phải hấp thụ năng lượng từ ngoài.

Các electron nằm ở obitan liên kết σ nhảy lên obitan phản liên kết σ*có mức năng lượng cao nhất, ứng với bước sóng 120 – 150 nm nằm ở vùng tử ngoại xa. Các electron π và các electron ρ (cặp electron tự do) nhảy lên obitan phản liên kết π* có mức năng lượng lớn hơn, ứng với bước sóng nằm trong vùng tử ngoại (200 – 400 nm) hay vùng khả kiến (400 – 800 nm) tùy theo mạch liên hợp của phân tử.

ước chuyển dời năng lượng : ở điều kiện bình thường, các electron trong phân tử nằm ở trạng thái cơ bản, khi có ánh sáng kích thích với tần số ν thích hợp thì các electron sẽ hấp thụ năng lượng và chuyển lên các trạng thái kích thích có mức năng lượng cao hơn. Theo cơ học lượng tử, ở trạng thái cơ bản các electron được sắp đầy vào các obitan liên kết σ, π hay n có mức năng lượng thấp, khi bị kích thích sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn:

Hình 15. Máy Quang phổ UV-VIS-NIR- V670

Việc đo phổ UV-VIS được thực hiện với điều kiện nhiệt độ phòng 25⁰C, dùng cuvettes thạch anh với khoảng đo từ 300nm – 600nm. Các mẫu đo được pha loãng với nước cất hai lần cho tới nồng độ khoảng 1mM (dùng micro pipet) rồi mới tiến hành đo để đảm bảo sự tương quan về nồng độ chất cần đo trong mẫu.

2.3.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction)

Phương pháp nhiễu xạ tia X được sử dụng để phân tích các vật liệu có cấu trúc, nó cho phép xác định hằng số mạng và các đỉnh đặc trưng cho các cấu trúc đó. Đối với

33

kim loại, phương pháp XRD cho phép xác định chính xác sự tồn tại của kim loại trong mẫu dựa trên các đỉnh thu được so sánh với các đỉnh chuẩn của nguyên tố đó.

Nguyên lý của phương pháp nhiễu xạ tia X : được mô tả như hình dưới đây

Hình 16. Nguyên lý của phương pháp nhiễu xạ tia X

Chùm tia X có bước sóng λ chiếu vào hai bề mặt cách nhau một khoảng cách d với góc tới θ. Khi chạm vào hai bề mặt trên, chùm tia tới sẽ bị chặn lại và sẽ xuất hiện chùm tia nhiễu xạ. Đây chính là hiện tượng nhiễu xạ. Góc giữa chùm tia tới và chùm tia nhiễu xạ là 2θ. Khi xảy ra cộng hưởng thì khoảng cách (A+ ) phải bằng một số nguyên lần bước sóng nλ.

Mặt khác, xét khoảng cách (A+ ), với hai pháp tuyến vuông góc với chùm tia tới và chùm nhiễu xạ, ta có :

Từ đó ta có phương trình : n λ = 2*d* sinθ

Đây chính là định luật nhiễu xạ ragg và số nguyên n có liên quan tới cấp độ nhiễu xạ

ví dụ : nếu d001 =10Å thì d002 =5Å, d003 =3.33Å …

Dựa trên giản đồ XRD, áp dụng công thức Scherrer, có thể tính được kích thước một cách tương đối của các hạt nano bạc tạo thành (chỉ dùng để so sánh các trường hợp vì tính chính xác không cao).

Công thức Scherrer : D

Với : D: kích thước tinh thể hạt

: Độ bán rộng của đỉnh đặc trưng

λ: ước sóng của chùm tia tới (λ=0.154nm) : Góc nhiễu xạ

34

Hình 17. Máy chụp nhiễu xạ tia X D8-Advance

Trong đề tài sử dụng máy D8 – Advance, điện áp gia tốc 40Kv, cường độ dòng 40mA, bức xạ Cu-Kanfa (dùng tấm lọc Ni), tốc độ quét 0.01⁰2 /0.2s, mẫu đo được thực hiện dưới nhiệt độ phòng 25⁰C.

2.3.4 Phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

Trong phân tích hóa học, phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật để xác định nồng độ của một nguyên tố kim loại nào đó trong mẫu. Kỹ thuật này có thể được sử dụng để phân tích 62 kim loại khác nhau trong cùng 1 dung dịch.

35

Nguyên lý : Kỹ thuật này sử dụng phổ hấp thụ để đánh giá nồng độ của chất cần phân tích trong mẫu. Nó chủ yếu dựa trên định luật Beer-Lambert. Về cơ bản, các electron của nguyên tử trong một thiết bị nguyên tử hóa có thể được kích thích nhảy lên những orbitan cao hơn bằng cách hấp phụ một năng lượng nào đó. Lượng năng lượng này là đặc trưng cho sự chuyển mức năng lượng của electron cụ thể trong một nguyên tố cụ thể, và mỗi bước sóng tương ứng với duy nhất một nguyên tố.

Với lượng năng lượng đưa vào ngọn lửa được biết trước và lượng năng lượng còn lại ở đầu bên kia (đầu dò) có thể đo được, theo định luật Beer-Lambert, ta có thể tính được số lượng chuyển mức năng lượng đã xảy ra, và từ đó ta biết được nồng độ của nguyên tố tương ứng cần đo.

Thiết bị: để phân tích thành phần nguyên tử của một mẫu, mẫu cần phải được nguyên tử hóa. Sau đó, mẫu sẽ được chiếu sáng. Ánh sáng truyền qua được đo bởi một đầu dò.

Để giảm sự ảnh hưởng của sự bức xạ từ máy phun hoặc từ môi trường, người ta thường sử dụng một quang phổ kế ở giữa máy phun và đầu đò. Các nguồn năng lượng có thể được sử dụng để tạo thành hơi nguyên tử : hồ quang điện, ngọn lửa và plasma.

Hình 19. Nguyên tắc hoạt động của máy hấp thụ nguyên tử

Qui trình thực hiện phân tích mẫu trong đề tài (được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Hóa phân tích, trường Đại học Khoa học Tự nhiên):

 Cân 0.1-1 gam mẫu ±0.1 mg vào ống HACH ( 10 mL), thêm từng giọt 7mL HNO3 1:1 (v/v).

 Vặn chặt nắp tránh dung dịch mẫu bị trào ra khi đun, chuyển ống Hatch vào bếp đun, bước đầu chỉnh nhiệt độ ở 90^oC và đun mẫu trong 30 phút, sau đó gia nhiệt đến 150^oC và giữ trong 45 phút.

36

 Tách riêng phần dung dịch. Rửa phần rắn 2 lần mỗi lần 10mL nước cất 2 lần, ly tâm.

 Gộp chung phần dung dịch và thêm nước đến chính xác khoảng 100g.

 Dung dịch này được đem đi xác định Ag và Na bằng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử ngọn lửa ( F-AAS).

 Đường chuẩn Na: nồng độ 0.1 – 10 ppm trong HNO3 0.5% pha loãng từ dung dịch Na 1000 ppm (Merck).

 Đường chuẩn Ag: nồng độ 0.1 – 10 ppm trong HNO3 0.5% pha loãng từ dung dịch trữ Ag 1000 ppm. Dung dịch trữ này đuợc pha từ muối AgNO3 dùng trong thí nghiệm tạo nano bạc.

2.3.5 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên phim quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ Nano. Nó cho phép quan sát chính xác cấu trúc Nano với độ phân giải lên đến 0,2 nm. Do đó, phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu Nano.

37

Hình 20. Máy chụp ảnh TEM JEM 1400

Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua: về mặt nguyên lý, TEM cũng có cấu trúc tương tự như kính hiển vi quang học với nguồn sáng (lúc này là nguồn điện tử), các hệ thấu kính (hội tụ, tạo ảnh…), các khẩu độ… Tuy nhiên, TEM đã vượt xa khả năng của một kính hiển vi truyền thống ngoài việc quan sát vật nhỏ, đến các khả năng phân tích đặc biệt mà kính hiển vi quang học cũng như nhiều loại kính hiển vi khác không thể có nhờ tương tác giữa chùm điện tử với mẫu.

Cơ chế tạo ảnh TEM : ảnh của TEM vẫn được tạo theo các cơ chế quang học, nhưng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm khác cơ bản của ảnh TEM so với ảnh quang học là độ tương phản khác so với ảnh trong kính hiển vi quang học và các loại kính hiển vi khác. Nếu như ảnh trong kính hiển vi quang học có độ tương phản chủ yếu đem lại do hiệu ứng hấp phụ ánh sáng thì độ tương phản của ảnh TEM lại chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử.

38

Hình 21. Cấu tạo của kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope – TEM) được chế tạo dựa trên cơ sở tổng hợp một số hệ thống khác nhau tạo thành một đơn vị chức năng có thể quan sát và chụp ảnh những mẫu rất mỏng. Những hệ thống đó bao gồm:

 Hệ thống chiếu sáng: súng phát điện tử và các thấu kính hội tụ để làm tăng và khống chế lượng bức xạ chiếu lên mẫu

 Hệ thống điều khiển mẫu: tầng buồng mẫu, các giá đỡ mẫu và các phần cứng cần thiết có liên quan nhằm định hướng mẫu ở bên trong cũng như ở bên ngoài thiết bị

 Hệ thống tạo ảnh bao gồm thấu kính vật, thấu kính trung gian và các thấu kính chiếu. Hệ thống này có chức năng tạo ảnh, hội tụ ảnh và phóng đại ảnh trên màn hình quan sát

 Hệ thống chân không để rút không khí ra khỏi cột kính

Hệ thống chiếu sáng Hệ thống thấu kính Hệ thống phân tích ảnh Súng phóng chùm electron Giá mẫu Khẩu độ hội tụ Màn hình hiển thị Vật kính

Khẩu độ trung gian Thấu kính trung gian Thấu kính nhiễu xạ Kính quan sát Màn huỳnh quang Các thấu kính ảnh Kính hội tụ Anod

39

Đề tài sử dụng máy JEM 1400 (Nhật) của Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia vật liệu Polymer & Compozit , Đại học ách Khoa , ĐHQG. TP. Hồ Chí Minh

Đặc điểm kỹ thuật

 JEM 1400 là thế hệ mới nhất của TEM 120KV với các đặc điểm ưu viết về hệ thống, bệ mẫu, các thấu kính quang học và vẫn duy trì các tính năng ưu việt của dòng TEM 120KV.

 Giao diện đồ họa (GUI) được lập trình trên phiên bản mới nhất của windows, là công cụ hữu hiệu cho việc điều khiển TEM.

 Độ phân giải cao: ảnh điểm: 0,38 nm, ảnh mạng: 0,2 nm. Thế gia tốc electron cực đại: 120KV. Độ phóng đại cực đại: 800 000.

 Hệ thống máy ảnh CCD cho chụp ảnh và xử lý trực tiếp không cần tráng rửa. Nguồn điện sử dụng 200V/ 50Hz và 380V/ 50Hz.

Hình 22. Qui trình chuẩn bị mẫu lỏng

Lưới đồng Lưới đồng phủ palladion Lưới đồng phủ palladion và cacbon

Thấm ướt với dung dịch chứa mẫu Mẫu đo

40

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Nano bạc đã sớm được chú ý đến và được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau từ phương pháp vật lý, hóa học đến sinh học,… Phương pháp hóa học là một phương pháp dễ làm, không đòi hỏi nhiều về trang thiết bị, dễ áp dụng trong công nghiệp, đưa đến ứng dụng trong cuộc sống, do đó chúng tôi chọn phương pháp hóa học chứ không phải là vật lý hay sinh học.

Trong phương pháp Hóa học, có nhiều tác chất đã được sử dụng để khử Ag+