Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp MPN (Most Probable Number)
3.4.1.1. Thử nghiệm giả định
Đối với mẫu nước khơng đóng chai: chọn dãy nồng độ pha lỗng kế tiếp nhau (10-2, 10-3, 10-4). Xếp 9 ống nghiệm chứa 10ml môi trường Lactose Broth vơ trùng có ống durham lên giá ống nghiệm làm 3 dãy. Dùng 1 pipet 1ml khử trùng hút 1ml
mẫu nước tại nồng độ 10-2 vào 3 ống dãy 1, tiếp tục lấy pipet 1ml vô trùng hút 1ml mẫu 10-3 vào 3 ống dãy 2. Tương tự, dùng pipet 1ml đã vô trùng hút 1ml mẫu 10-4
vào 3 ống dãy 3. Lắc nhẹ mỗi ống để trộn đều mẫu nước với môi trường nuôi cấy, tránh tạo bọt khí. Cần lưu ý, mỗi độ pha lỗng là 1 pipet 1ml mới. Thực hiện tương tự như vậy cho 2 mẫu nước khơng đóng chai cịn lại.
Đối với mẫu nước đóng chai: cũng thực hiện tương tự như trên nhưng chọn dãy nồng độ kế tiếp nhau (10ml; 1ml; 0,1ml). Xếp 9 ống nghiệm chứa 10ml môi trường Lactose Broth vơ trùng có ống durham lên giá làm 3 dãy. Dùng pipet khử trùng loại 10ml hút 10ml mẫu cho vào 3 ống dãy 1, lấy pipet khử trùng 1ml hút 1ml mẫu vào 3 ống dãy 2, cuối cùng dùng đầu týp khử trùng hút 0,1ml mẫu vào 3 ống dãy 3. Mỗi độ pha loãng dùng 1 pipet mới và cứ thế tiếp tục thực hiện cho hết 7 mẫu nước đóng chai.
Tất cả 90 ống nghiệm (10 mẫu x 9 ống) này, được ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ quan sát sự sinh hơi và ghi nhận lại những ống sinh hơi chứng tỏ thử nghiệm giả định dương tính (+).
Số lượng ống nghiệm dương tính được chia làm hai để tiến hành thử nghiệm xác định Coliform và tiếp tục thử nghiệm giả định E.coli.
Tiếp tục thử nghiệm giả định E.coli
Lắc đều và dùng que cấy vòng lấy từ các ống thử nghiệm giả định dương tính cấy chuyển vào các ống chứa 10ml môi trường EC vơ trùng có ống durham. Sau đó đem ủ ở 440C trong 24 giờ, quan sát sự sinh hơi chứng tỏ thử nghiệm giả định dương tính.
Các ống nghiệm dương được lắc đều và cấy chuyển sang môi trường thạch EMB, mang ủ ở 370C trong 24 giờ xem khuẩn lạc E.coli giả định (khuẩn lạc E.coli có ánh kim tím, trịn và dẹt).
Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thử nghiệm IMViC: canh trypton, canh MR – VP, môi trường thạch nghiêng Simmon Citrate. Mang ủ các môi trường đã cấy ở 370C trong 24 giờ rồi tiến hành thử nghiệm sinh hóa.
3.4.1.2. Thử nghiệm xác định Coliforms
Lắc đều và dùng que cấy vòng lấy từ các ống thử nghiệm giả định dương tính cấy chuyển vào các ống chứa 10ml mơi trường BGBL vơ trùng có ống durham. Sau đó, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Quan sát sự sinh hơi và ghi nhận các ống dương chứng tỏ thử nghiệm xác định dương tính.
3.4.1.3. Thử nghiệm sinh hóa đối với E.coli a. Thử nghiệm Indol
Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn trong môi trường canh trypton. Phản ứng (+) khi bề mặt có vóng trịn đỏ cánh sen xuất hiện, phản ứng (-) khi khơng có vịng trịn đỏ xuất hiện.
b. Thử nghiệm Methyl Red
Nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn lỏng môi trường MR – VP, lắc đều. Phản ứng (+) khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng (-) khi canh khuẩn không đổi màu.
c. Thử nghiệm Voges Proskauer (VP)
Cho 2 – 3 giọt thuốc thử α – naphthol 5% vào canh khuẩn, lắc đều và cho tiếp vào đó 6 – 9 giọt KOH 40%. Quan sát màu sắc của canh khuẩn trong 10 – 30 phút. Phản ứng (+) khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng (-) khi canh khuẩn không đổi màu.
Quan sát trên môi trường Simmon Citrate: phản ứng (+) khi môi trường thạch nghiêng chuyển sang màu xanh dương, phản ứng (-) khi môi trường không đổi màu (màu xanh lục).
Bảng 3.1: Biểu hiện trên môi trường của E.coli
Môi trường Phản ứng Biểu hiện môi trường
Canh Trypton
Thử nghiệm Methyl Red Thử nghiệm Voges Proskauer Citrate
++ + - -
Vòng đỏ cánh sen xuất hiện bề mặt. Môi trường chuyển sang đỏ. Môi trường không chuyển màu. Khơng có sinh khối và mơi trường khơng chuyển màu.
3.4.1.4. Đọc kết quả
Dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha lỗng.
3.4.2. Xử lý số liệu
Hình 3.1: Quy trình định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp MPN Mẫu nước đóng chai khơng pha lỗng hút 10ml, 1ml, 0.1ml
Hút tương ứng với 1 nồng độ vào ống 10ml Lactose Broth, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, ủ ở 370C trong 24 giờ.
Ghi nhận số ống dương (+) Lactose Broth
Cấy vào ống 10ml BGBL, ủ ở 370C trong 24 giờ. Ghi nhận số ống dương.
Đọc kết quả, tra bảng Mac Cardy.
Cấy vào ống 10ml EC Broth, ủ 440C trong 24 giờ.
Ghi nhận số ống dương. Cấy vào môi trường thạch đĩa
EMB, ủ 370C trong 24 giờ. Quan sát khuẩn lạc E.coli có ánh
kim tím, trịn, dẹt.
Cấy khuẩn lạc đặc trưng vào môi trường thử nghiệm IMViC (môi
trường Trypton, Methyl Red, Voges Proskauer, Simmon Citrate), ủ ở 370C trong 24 giờ.
Tiến hành thử nghiệm IMViC. Đọc kết quả, tra bảng
Hình 3.2: Biểu hiện E.coli và Coliforms lần lượng trong EC Broth và BGBL 1: mẫu đối chứng không, 2: mẫu dương; 3: mẫu không, 4: mẫu dương
Hình 3.4: Biểu hiện sinh hóa của E.coli