2.3.2.1. Đánh giá tiểu phân nano Curcumin.
a. Đánh giá hình thái và kích thước hệ nano bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM – Scanning Electron Microscope )
Nguyên tắc: sử dụng kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S-4800 có độ phóng đại M=20x-800000x; độ phân giải δ=1,0 nm; điện áp gia tốc U=0,5-30 kV. Chùm điện tử quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu được thu lại bởi các đầu dò để biến đổi thành những tín hiệu phản ánh bề mặt, thành phần của mẫu đưa ra màn hình quan sát. Do cách tạo ảnh, các ảnh SEM có đặc điểm của ảnh ba chiều [6].
Tiến hành: phân tán mẫu bột phun sấy trên một khung carbon, sau đó phủ một lớp platin rồi đặt vào buồng soi mẫu của thiết bị.
b. Đánh giá kích thước và phân bố kích thước bằng thiết bị đo thể zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 Malvern
Nguyên tắc: dựa vào dao động cường độ tán xạ ánh sáng của tiểu phân để tính toán kích thước hạt. Thiết bị chiếu tia la-de vào mẫu đo rồi thu nhận cường độ tán xạ của các tiểu phân. Các tiểu phân ở các vị trí khác nhau tạo ra cường độ tán xạ khác nhau. Mặt khác do tiểu phân di chuyển theo chuyển động Brown nên tạo ra dao động cường độ tán xạ trên detector. Các tiểu phân có kích thước khác nhau có vận tốc chuyển động Brown khác nhau nên có dao động của cường độ tán xạ khác nhau. Detector ghi lại dao động cường độ tán xạ và tính vận tốc chuyển động Brown của hạt, qua đó xác định được kích thước của hạt theo phương trình Stockes-Einstein [21]. Tiến hành: chuẩn bị mẫu là hỗn dịch nano hoặc phân tán bột phun sấy trong nước tinh khiết đã lọc qua màng 0,2μm, sao cho hàm lượng dược chất khoảng 0,1 mg/ml.
c. Phương pháp đo thế zeta
Thế zeta được xác định bằng phương pháp điện di trên thiết bị gồm kính hiển vi để theo dõi quãng đường di chuyển của các tiểu phân điện tích trong điện trường giữa 2 cực platin. Thời gian tự động hóa gắn trong thiết bị đo [8], [13] . Giá trị thế zeta được tính theo công thức smoluchowsky [5]:
ƺ = 4𝜋𝜂
𝜀 × U × 300 × 300 × 100 Trong đó: U = 𝐸𝑉
𝐿
⁄ : độ di chuyển của hạt trong điện trường E : điện thế áp vào hệ đo
L : khoảng cách 2 điện cực V : tốc độ di chuyển của hạt η : độ nhớt của môi trường
d. Quét nhiệt vi sai (DSC - Differential scanning calorimetry)
Phương pháp quét nhiệt vi sai là phương pháp phân tích mà trong đó các tính chất vật lý, hóa học đo liên tục theo hàm của nhiệt độ dựa trên sự khác nhau về nhiệt lượng trong khi mẫu đo và mẫu chuẩn ở cùng nhiệt độ [32], [18].
- Mẫu bột được đặt trong đĩa nhôm đục lỗ kín với lượng 5-10 mg. Các phân tích nhiệt được thực hiện với nhiệt độ quét trong phạm vi 25-250oC và tốc độ gia nhiệt 10oC/phút. Trong quá trình có sử dụng khí Nitơ.
e. Phương pháp phân tích phổ nhiễu xạ tia X (XRD – X-ray diffraction)
Để nghiên cứu về tinh thể người ta dùng bước sóng 0,5 – 2,5 Ao. Khi chùm tia X đập vào mặt tinh thể và đi vào trong thì mạng tinh thể đóng vai trò một cách tử nhiễu xạ đặc biệt. Mật độ và cường độ các pic trong phổ XRD thể hiện mức độ kết tinh của dược chất [18].
f. Phương pháp định lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu
Hàm lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu được định lượng bằng phương pháp đo quang [4]. Các bước tiến hành như sau:
- Dung môi pha loãng (dung dịch Tween 80 0,2%): cân 2g Tween 80 vào cốc có mỏ, thêm nước cất và đun nóng trên bếp điện hoặc nồi cách thủy đến khi tan hoàn toàn. Thêm nước vừa đủ 1000ml.
- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10mg curcumin hòa tan trong 10ml methanol, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch, lắc kỹ. Hút chính xác 2ml dung dịch này cho sang bình định mức 50ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ.
- Dung dịch thử: làm tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thay curcumin nguyên liệu bằng một lượng bột curcumin phun sấy tương ứng với 10mg curcumin.
- Đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu thử tại bước sóng 427 nm, mẫu trắng là dung môi pha loãng. Tính hàm lượng curcumin theo công thức:
% CURCUMIN = DT Dc × mc
Trong đó: DT, Dc: Độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn.
mt, mc: Khối lượng curcumin có trong mẫu thử, mẫu chuẩn (g). Mỗi mẫu thử làm 3 lần lấy kết quả trung bình [4].
g. Đánh giá độ tan của curcumin nguyên liệu và nano curcumin trong bột phun sấy.
Phương pháp đánh giá độ tan của curcumin nguyên liệu và hệ nano curcumin được tiến hành như sau:
- Cân lượng bột tương ứng với 0,1 g curcumin, phân tán trong 100ml nước tinh khiết.
- Khuấy từ trong 24 giờ, nhiệt độ 25oC.
- Hút 10 ml dung dịch thử, lọc qua màng cellulose kích thước lỗ lọc 5 µm, ly tâm 10 phút với tốc độ 12000 vòng/phút.
- Dịch trong đem đo quang ở 427 nm (pha loãng nếu cần). Mẫu trắng là nước cất.
Dung dịch chuẩn được chuẩn bị như phần như định lượng. Độ tan của curcumin được tính theo công thức:
Ct= 𝐷𝑡
𝐷𝑜 × Co × K
Trong đó Co, Ct: nồng độ curcumin của mẫu chuẩn, mẫu thử (mg/ml). Do, Dt: độ hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử.
K : hệ số pha loãng.
h. Đánh giá độ hòa tan của curcumin trong bột phun sấy.
Mức độ và tốc độ hòa tan của curcumin nguyên liệu và curcumin từ hệ nano được xác định bằng phép thử độ hòa tan với các điều kiện cụ thể như sau:
- Thiết bị: máy cánh khuấy, tốc độ quay 100 vòng/phút ± 1 vòng/phút. - Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch Tween 80 nồng độ 0,2%. - Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37oC ± 0,5oC.
- Khối lượng mẫu thử: tương ứng với 5mg curcumin. Tiến hành:
Cho các mẫu thử vào cốc có chứa môi trường hòa tan, cho máy hoạt động. Sau các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút lấy mẫu một lần. Mỗi lần lấy
khoảng 10ml dung dịch thử, ly tâm 5 phút với tốc độ 12000 vòng/phút. Phần dịch đem đo quang ở bước sóng 427nm, sử dụng mẫu trắng, dung môi pha loãng là dung dịch Tween 80 0,2% trong nước. Sau khi đo quang bổ sung lại toàn bộ phần cắn và phần dịch ly tâm vào cốc hòa tan.
Pha mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10mg curcumin hòa tan trong 10ml methanol, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch, lắc kỹ. Hút chính xác 2ml dung dịch này cho sang bình định mức 50ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ.
Cách tính kết quả:
Nồng độ curcumin ở thời điểm t: Cn =
Trong đó:
Phần trăm curcumin đã hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức % Curcumin = Cn x 900
m x 1000 x 100%
Cn: nồng độ curcumin tại thời điểm t (µg/ml) m: hàm lượng curcumin trong mẫu (µg) Mỗi mẫu thử 3 lần lấy kết quả trung bình..
i. Xác định khối lượng riêng biểu kiến.
Nguyên tắc: một lượng bột có khối lượng xác định được cho vào ống đong chính xác, đọc thể tích khối bột, sau đó đặt lên máy và gõ với tần số xác định để có thể tích không đổi. Khối lượng riêng biểu kiến là tỷ lệ giữa khối lượng và thể tích sau khi gõ khối bột [1].
Tiến hành: cân m (g) bột cho vào ống đong 5 ml. Ống đong được đặt lên máy đo tỷ trọng Erweka SVM. Đọc thể tích không đổi sau khi gõ.
Khối lượng riêng biểu kiến được tính theo công thức sau: Dbk = M/V
Trong đó Dbk :khối lượng riêng biểu kiến của khối bột (g/ml).
Cn,Co: là nồng độ dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml) Dn,Do: là độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Dn × Co
M : khối lượng bột phun sấy trong ống đong (g) . V :thể tích bột sau khi gõ (ml).
k. Hàm ẩm khối bột sau phun sấy
Xác định theo phương pháp mất khối lượng do làm khô. Tiến hành trên cân xác định hàm ẩm Sartorius MA30. Nhiệt độ đo 100oC.
l. Hiệu suất của quá trình bào chế (H%): bằng khối lượng curcumin tương ứng với khối lượng sản phẩm thu được chia cho khối lượng curcumin ban đầu.
H% = 𝑀𝑠𝑝
𝑀𝑏đ × 100%
Trong đó Msp : Khối lượng curcumin tương ứng với khối lượng sản phẩm (g) Mbđ : Khối lượng curcumin ban đầu
2.3.2.2 Đánh giá viên nang curcumin
- Đánh giá độ hòa tan viên nang curcumin 50 mg.
Độ hòa tan của curcumin từ viên nang nano curcumin – 50mg được đánh giá tương tự như phương pháp đánh giá độ hòa tan tiểu phân nano ở mục 2.3.2.1.
Mẫu chuẩn được chuẩn bị từ 50 mg curcumin và 1 vỏ nang rỗng.
Mẫu thử được chuẩn bị từ 900 ml dung dịch Tween 0,2 % và 1 vỏ nang rỗng.