3.1.2.1 Địa điểm lấy mẫu
Mẫu thực phẩm lấy tại 3 tiệm ăn gần trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM:
Tiệm 1: Quán cơm L25. đường D2, khu Văn Thánh Bắc, quận Bình Thạnh Tiệm 2: Quán cơm Duyên. 38 đường D2, khu Văn Thánh Bắc, quận Bình
Thạnh
Tiệm 3: Quán cơm 999.134/5 Lô X, đường D2, khu Văn Thánh Bắc, quận Bình Thạnh.
3.1.2.2 Địa điểm thực hiện
Thực hiện phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm vi sinh của trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM
3.1.2 Thời gian thực hiện đề tài:
Ngày 01 tháng 4 năm 2009 đến ngày 30 tháng 6 năm 2009 3.2 Vật liệu
3.2.1 Mẫu
Năm loại mẫu thực phẩm phân tích Đậu hủ nhồi thịt
Xíu mại Chả thịt chưng Cá basa kho Hến sào
3.2.2 Hóa chất, môi trường
Saline pepton water (SPW) (Ấn Độ)
Plate count agar pH 7,0 ± 0,2(PCA) (Ấn Độ)
Tryptone Soya Agar ( TSA) (Ấn Độ)
Violet Red Bile Agar ( VRB) (Ấn Độ)
Brilliant Green Bile Lactose broth ( BGBL) (Ấn Độ)
26
Canh Tryptone (Ấn Độ)
Canh Methyl red Voges-Proskauer ( MR-VP) (Ấn Độ)
Thạch Simmon Citrate (Ấn Độ)
Thuốc thử Kovac,s Thuốc thử Methyl red Thuốc thử 1α-napthol 5% KOH 40 % NaCl Cồn 70 % và cồn 96 % Nước cất 3.2.3 Dụng cụ Ống nghiệm có nấp Đĩa petri vô trùng Pipette 5ml, 10ml Cân điện tử Bình tam giác Cốc thủy tinh Kéo Đũa khuấy
Túi nylon vô khuẩn Đèn cồn
Que cấy vòng Que cấy thẳng
Bình chứa môi trường Khăn giấy
Bông y tế
Bông không thấm nước 3.2.4 Thiết bị
Autoclave Tủ lạnh Bếp từ
27 Tủ ấm 44oC Tủ ấm 30oC Tủ ấm 37oC Tủ sấy 180oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt
3.3 Phương pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.1 Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu 3.3.1.1 Thu mẫu 3.3.1.1 Thu mẫu
Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang về phòng thí nghiệm phản ánh dúng tình trạng mẫu cần phân tích
Dụng cụ lấy mẫu bằng kim loại vô trùng. Mẫu sau khi lấy cho vào nilon sạch vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Trong trường hợp nơi lấy mẫu quá xa phòng thí nghiệm phải ướp đá để mang về. các mẫu thực phẩm sau khi lấy phải đảm bảo không nhiễm lẩn nhau.
3.3.1.2 Bảo quản mẫu
Khối lượng mẫu tối thiểu từ 100-250g tùy vào yêu cầu phân tích. Mẫu lấy tại nhiều vị trí trên bề mặt sản phẩm
Sau khi mang về phòng thí nghiêm nếu không phân tích ngay thì mẫu được bảo quản ở 0-4oC và thời gian bảo quản không quá 36 giờ.[6]
3.3.1.3 Chuẩn bị mẫu
Rã đông trước khi phân tích: Rã đông phải đảm bảo mẫu vẫn không bị nhiễm.Tránh tình trạng đổi bao đựng cho mẫu. Rã đông thông thường từ 2-5oC trong 18 giờ tuy nhiên thời gian không cho phép nên thường áp dụng biện pháp rã đông ở 45oC trong 15 phút. Khi rã đông ở nhiệt độ cao phải lác đều mẫu nhằm rút ngắn thời gian rã đông và làm nhiệt độ mẫu dồng đều.
Cân mẫu: các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần dảm bảo vô trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích. Trong dề tài này khối khối lượng mẫu cân là 25g.
28
Đồng nhất mẫu khi phân tích: sự phân phối của vi sinh vật không đồng đều nhau, để đảm bảo tính đồng nhất trong mẫu các mẫu lỏng phải lắc đều trước khi phân tích. Nếu là mẫu bán rắn phải cắt mẫu hay nghiền mẫu bằng thiết bị chuyên dùng.
Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau:
Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng : bơm chính xác 9ml dung dịch pha loang vào ống nghiệm có nắp.
Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn.[5]
Pha loãng mẫu
Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 Pha loãng Độ pha loãng 10-5
105 Độ pha loãng cuối
29
3.3.2 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)bằng phương pháp đổ đĩa đĩa
3.3.2.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.3.2.2 Nguyên tắc
Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất váo trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 3 ngày. [1]
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy để quy về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm. [5]
3.3.3.3 Quy trình phân tích[5]
Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây được độ pha loãng 10-1
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4.
Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ
Hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã khử trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
loãng làm 2 đĩa.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm
30 3.3.2.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu
Dịch được đồng nhất xong tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục làm đến độ pha loãng 10-4.
Cấy mẫu.
Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4. Dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoãng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều. Chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ trong tủ 30oC
Sau 72 giờ chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đến.
Đĩa petri vô trùng PCA 45oC 10 -15 ml Dung dịch mẫu đã pha loãng 1 ml
Lắc đều đĩa petri Để nguội Lật ngư ợc đĩa Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả
31 3.3.2.5 Ghi kết quả
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả sau khi đếm khuẩn lạc[1]
Nồng độ pha loãng Kết quả
10-2 10-3 10-4
Đĩa 1 Đĩa 2
- Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/g
- Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/g
- Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc Công thức tính kết quả:
Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng
3.3.3 Định lượng Coliforms tổng số bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
3.3.3.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.3.3.2 Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 37oC sau 24-
48 giờ. Ngoài lactose môi trường chọn lọc cho coliforms còn chứa muối mật ức chế
vi khuẩn gram dương. Trên môi trường này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đường
(cfu/g) ... 1 1 1 V f ni Vi fi n N A (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
32
kính > 0,5cm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL
Để phát hiện được bộ phận tế bào bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không phát triển được trong môi trường chọn lọc, do đó trước tiên mẫu phải được cấy vào môi trường tăng sinh không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.[1]
3.3.3.3 Quy trình phân tích.[6]
Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm
Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã khử trùng
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều
33 3.3.3.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu.
Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa.
Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để nguôị 45oC, lắc đều để dặc môi trường. Giai đoạn này nhằn chọn lọc vi khuẩn
coliforms.
Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ
Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của coliforms có
màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm
TSA ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1 1 ml Lắc để yên 1 – 2h VRB ở 45oC 10 ml
Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Phục hồi VSV Chọn lọc KL coliform
34 Thử nghiệm khẳng định.
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R.
Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGB L
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.4 Khẳng định Coliforms
3.3.3.5 Ghi kết quả
Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi.
Công thức tính Tổng số coliforms (cfu/g).
Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng.
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy).
Ghi nhận kết quả: Tổng số coliforms phát hiện trong 25g mẫu.
3.3.4 Định tính E.coli bằng phương pháp cấy ria và xét nghiệm sinh hóa
IMViC
R nVf
N
35 3.3.4.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm , đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm
3.3.4.2 Nguyên tắc
Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC).[1]
3.3.4.3 Quy trình phân tích [5]
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu.
Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-)
Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC
Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm
36 3.3.4.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu.
Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC
Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính9 làm đục môi trường và
có sinh hơi. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC.
Nhận dạng khuẩn lạc E.coli Khuẩn lạc màu tím,ánh kim bờ tròn, đều đường kính
khoảng 0.5mm. Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc.
Thử nghiệm khẳng định. [3]
Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMVIC. Thực hiện như sau.
Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh
Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac. Phản ứng dương(+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện.
Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi truo2ng chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng.
Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt 3m dung dịch 1-αnapthol 5% trong cồn bổ sung them 3ml dung dịch KOH 40 % hay NaOH 40 %. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu.