Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây được độ pha loãng 10-1
Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4.
Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ
Hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã khử trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha
loãng làm 2 đĩa.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm
30 3.3.2.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu
Dịch được đồng nhất xong tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục làm đến độ pha loãng 10-4.
Cấy mẫu.
Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4. Dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoãng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều. Chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ trong tủ 30oC
Sau 72 giờ chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đến.
Đĩa petri vô trùng PCA 45oC 10 -15 ml Dung dịch mẫu đã pha loãng 1 ml
Lắc đều đĩa petri Để nguội Lật ngư ợc đĩa Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả
31 3.3.2.5 Ghi kết quả
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả sau khi đếm khuẩn lạc[1]
Nồng độ pha loãng Kết quả
10-2 10-3 10-4
Đĩa 1 Đĩa 2
- Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/g
- Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/g
- Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc Công thức tính kết quả:
Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng
3.3.3 Định lượng Coliforms tổng số bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
3.3.3.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.
3.3.3.2 Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 37oC sau 24-
48 giờ. Ngoài lactose môi trường chọn lọc cho coliforms còn chứa muối mật ức chế
vi khuẩn gram dương. Trên môi trường này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đường
(cfu/g) ... 1 1 1 V f ni Vi fi n N A
32
kính > 0,5cm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL
Để phát hiện được bộ phận tế bào bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không phát triển được trong môi trường chọn lọc, do đó trước tiên mẫu phải được cấy vào môi trường tăng sinh không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.[1]
3.3.3.3 Quy trình phân tích.[6]
Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm
Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã khử trùng
Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ
Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều
33 3.3.3.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu.
Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa.
Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để nguôị 45oC, lắc đều để dặc môi trường. Giai đoạn này nhằn chọn lọc vi khuẩn
coliforms.
Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ
Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của coliforms có
màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm
TSA ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1 1 ml Lắc để yên 1 – 2h VRB ở 45oC 10 ml
Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Phục hồi VSV Chọn lọc KL coliform
34 Thử nghiệm khẳng định.
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R.
Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGB L
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy)
Hình 3.4 Khẳng định Coliforms
3.3.3.5 Ghi kết quả
Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi.
Công thức tính Tổng số coliforms (cfu/g).
Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ.
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng.
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy).
Ghi nhận kết quả: Tổng số coliforms phát hiện trong 25g mẫu.
3.3.4 Định tính E.coli bằng phương pháp cấy ria và xét nghiệm sinh hóa
IMViC
R nVf
N
35 3.3.4.1 Ý nghĩa
Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm , đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm
3.3.4.2 Nguyên tắc
Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC).[1]
3.3.4.3 Quy trình phân tích [5]
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu.
Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-)
Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC
Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây
Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm
36 3.3.4.4 Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu.
Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.
Cấy mẫu.
Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC
Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính9 làm đục môi trường và
có sinh hơi. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC.
Nhận dạng khuẩn lạc E.coli Khuẩn lạc màu tím,ánh kim bờ tròn, đều đường kính
khoảng 0.5mm. Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc.
Thử nghiệm khẳng định. [3]
Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMVIC. Thực hiện như sau.
Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh
Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac. Phản ứng dương(+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện.
Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi truo2ng chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng.
Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose
photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt 3m dung dịch 1-αnapthol 5% trong cồn bổ sung them 3ml dung dịch KOH 40 % hay NaOH 40 %. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu.
37
Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon
Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu.
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá
TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả
1 Indol +
2 Methyl red +
3 Voges Prokauer -
4 Khả năng sử dung citrate -
3.3.4.5 Ghi kết quả
Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMVIC có kết quả (+ + - - )
Không phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMVIC không có kết quả (+ + - - ) Phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 25g mẫu
3.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bắt đầu ngày 01/04/09, Lấy mẫu thức ăn chế biến sẵn tại 3 tiệm ăn gần trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM
Đánh giá cảm quan mẫu Bảo quản mẫu + Ngày phân tích
+ Chuẩn bị mẫu phân tích
Phân tích một số chỉ tiêu vi sinh + Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí
+ Chỉ tiêu coliforms tổng số + Định tính E.coli
- Đánh giá kết quả các chỉ tiêu vi sinh phân tích
- Đưa ra những khuyến cáo về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm tại các tiệm ăn - Đề xuất một số giải pháp nhầm nâng cao chất lượng VSATTP tại các tiệm lấy mẫu phân tích
38 Phân tích 5 loại mẫu lấy tại 3 địa điểm trên
Tổng số mẫu đã lấy trong suốt thời gian thực hiện đề tài là 27 mẫu. Thời gian phân tích một mẫu là 4 ngày, một lần thực hiện 2-3 mẫu.
Mỗi mẫu phân tích 3 chỉ tiêu vi sinh: - Tổng số vi sinh vật hiếu khí
- Định lượng Coliforms - Định tính E.coli
39
Chương IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả đánh giá cảm quan Màu sắc và trạng thái mẫu Màu sắc và trạng thái mẫu
- Các mẫu đậu hủ nhồi thịt chế biến từ thịt lợn và đậu hủ miếng chiên, mẫu có màu vàng ống, có nước sệt.
- Các mẫu xíu mại chế biến từ thịt lợn, mẫu có màu vàng cam, có nước sền sệt. - Các mẫu chả thịt chưng chế biến từ thịt lợn, trứng, và bún. Trên bề mặt mẫu
có màu vàng nhạt, phía dưới có màu xám trắng, mẫu khô.
- Các mẫu hến xào chế biến từ hến. Mẫu có màu trắng ngà, không có nước. - Các mẫu cá Basa kho chế biến từ cá Basa, khứa thành từng đoạn ngắn, da cá
được làm trắng. Mẫu có nước màu cánh dán. Mùi và vị
Các mẫu thu được có mùi, vị đặc trưng của từng món. Không có mẫu nào có mùi lạ hay vị lạ (không hỏng hay ôi thiu).
Hình 4.2 Mẫu xíu mại
Hình 4.3 Mẫu chả thịt chưng Hình 4.1 Mẫu chả thịt chưng
40
Nhận xét: Nhìn chung các mẫu được lấy vẫn trong tình trạng rất tốt, màu sắc và mùi, vị bắt mắt không có biểu hiện của sự hư hỏng hay ôi thiu. Do các mẫu được lấy vào khoảng thời gian 12 giờ trưa, mẫu được lấy thường có nhiệt độ khoảng 50oC, lúc này là giờ cơm trưa các mẫu vừa đươc chế biến xong, đang trong tình trạng tốt nhất để phục vụ thực khách.
4.2 Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật 4.2.1 Chỉ tiêu Tổng vi sinh vật hiếu khí 4.2.1 Chỉ tiêu Tổng vi sinh vật hiếu khí
4.2.1.1 Đánh giá chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí của các mẫu chế biến từ thịt
Bảng 4.1: Kết quả phân tích TPC của các mẫu chế biến từ thịt
Mẫu Tổng vi sinh hiếu khi
(CFU/g) 1Đ1 2.3x104 1Đ2 3.7x106 1Đ3 2.2x104 1X1 1.1x105 1X2 4.0x104 1X3 1.6x104 1C1 1.2x104 1C2 2.5x104 1C3 1.5x104 2Đ1 1.3x104 2Đ2 2.2x104
Hình 4.5 Mẫu cá basa kho Hình 4.4 Mẫu hến xào
41 2Đ3 2.0x104 2C1 1.6x104 2C2 4.4x104 2C3 1.9x104 2C1 1.6x104 2C2 4.0x104 2C3 2.0104
Tổng số vi sinh vật của các mẫu chế biến từ thịt
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 1X1 1X2 1X3 1C1 1C2 1C3 2C1 2C2 2C3 3C1 3C2 3C3 Mẫu
Hình 4.6 Biểu đồ biểu diễn tổng vi sinh vật hiếu khí của các mẫu chế biến từ thịt Dựa vào biểu đồ hình 4.1: Trong các mẫu được phân tích có nguyên liệu chế biến từ thịt có một mẫu là đậu hủ nhồi thịt củ tiệm cơm L25 (3.7x106 CFU/g) vượt tiêu chuẩn so với “tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ y tế 4/1998” (3x105 CFU/g). Còn tất cả các mẫu còn lại chế biến từ thịt cho kết quả phân tích TPC thấp hơn tiêu chuẩn cho phép.
Trong tổng số 18 mẫu chế biến từ thịt được phân tích có 1 mẫu không đạt tiêu chuẩn so với “tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm, Bộ y tế 4/1998”. Tuy chỉ có 1 mẫu vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhưng đối với những sản phẩm phục vụ con người và có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe thì vấn đề đáng lưu tâm vì các món ăn tại tiệm thường được bố trí chung nên khả năng nhiễm chéo từ món này sang món khác rất dễ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ bình thường. Do đó, trong một khoảng thời
42
gian nhất định, các món ăn này sẽ bị nhiễm. Điều đó rất nguy hiểm đến sức khỏe người tiêu dùng.
Có thể phân tích một số nguyên nhân gây nhiễm tổng vi sinh hiếu khí đối với mẫu đậu hủ nhồi thịt của tiệm cơm L25
- Mẫu được chế biến từ nguyên liệu là thịt lợn và đậu, đậu hủ miếng chiên. Có thể nguồn nguyên liệu chứa nhiều vi sinh vật hiếu khí. Đây là món ăn đòi hỏi phải thao tác thủ công bằng tay nhiều như băm thịt, mổ đậu hủ và dùng tay nhồi thịt vào đậu hủ từ đó dễ dẫn đến nhiễm vi sinh từ dụng cụ, từ tay người chế biến, từ không khí…
- Nấu chưa kỹ, chưa dủ thời gian để diệt các vi sinh vật hiếu khí.
- Không gian của tiệm ăn quá chật hẹp, đông người ra vào đây có thể là nguyên nhân chính
- Nơi chế biến và vệ sinh dụng cụ nấu ăn gần toilet rất dễ lây nhiễm các loại vi sinh khác
- Người dứng bán cơm trực tiếp không mang găng tay…