A .Nội dung
1. Yêu cầu về kỹ thuật sản xuất
1.2. Giới thiệu quy trình sản xuất cây mẹ đầu dòng từ vi ghép đỉnh sinh trƣởng
trƣởng
Quy trình công nghệ sản xuất cây giống cây có múi sạch bệnh
1.2.1.Tạo cây đầu dòng sạch bệnh (cây So) bằng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trƣởng Nguyên tắc làm sạch bệnh của phƣơng pháp này dựa vào đặc điểm lây lan của bệnh vàng lá greening (VLG) và các bệnh virus, viroid của cây có múi:
- Bệnh chỉ lan truyền trong cây theo mạch dẫn - Bệnh không lây lan qua hạt.
Đỉnh sinh trƣởng gồm mô phân sinh chƣa hình thành mạch dẫn do vậy sạch bệnh. Ghép mảnh mô phân sinh lên mầm cây mọc từ hạt sẽ nhận đƣợc cây sạch bệnh. Cách ghép này chỉ thực hiện đƣợc trong phòng thí nghiệm dƣới kính hiển vi do mảnh ghép mô phân sinh có kích cỡ rất nhỏ 100 - 150 nanomet (100 - 150 phần nghìn mét) và gốc ghép chỉ là đoạn mầm mọc từ hạt nuôi trong ống nghiệm. Vi ghép đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng nên hoàn toàn sạch bệnh.
Hình 1: Đỉnh sinh trƣởng
Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trƣởng (Microshoot tip grafting) đƣợc Murashige áp dụng lần đầu tiên vào năm 1972 sau đó đƣợc cải tiến hoàn chỉnh hơn bởi Navarro 1975, 1976, 1980, 1981 và Hong Ji Su 1984. Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trƣởng bao gồm các giai đoạn: chuẩn bị gốc ghép, chuẩn bị đỉnh sinh trƣởng, vi ghép nuôi cây trong ống nghiệm và sau đó đem trồng ra chậu.
QUY TRÌNH SẢN XUẤT CÂY CÓ MÚI SẠCH BỆNH Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy:
2. Môi trƣờng nuôi cây sau khi vi ghép: Sử dụng môi trƣờng MS lỏng có bổ xung BA (0 - 500µl/l môi trƣờng)
Bƣớc 2: Chuẩn bị cây gốc ghép: (mọi thao tác phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô
trùng).
- Xử lý hạt để gieo làm cây gốc ghép: lấy hạt của các giống cam 3 lá và bƣởi chua.
- Hạt gốc ghép: lột vỏ, khử trùng với canxi hypochloride 10% trong 15 phút, rửa lại 3 lần với nƣớc cất đã đƣợc tiệt trùng.
- Gieo hạt gốc ghép trong ống nghiệm có sẵn môi trƣờng MS đặc đã hấp khử trùng, sau đó để cây trong tối, nhiệt độ 280
C, 14-16 ngày là có thể vi ghép.
- Tiêu chuẩn cây gốc ghép: chiều cao 10 - 12 cm, đƣờng kính thân 1,5 - 2 mm.
Hình 2: Gốc ghép volka gieo trong ống nghiệm ( Nguồn Viện cây ăn quả miền Nam)
Bƣớc 3: Chuẩn chồi ghép (mắt ghép):
Chồi ghép đƣợc thu bằng nhiều cách (thu chồi dài khoảng 1,5 – 2cm): Chồi từ cành ủ trong ống nghiệm
Chồi tồn trử sẳn trong phòng thí nghiệm Từ chồi cây trực tiếp ngoài đồng
Hình 3:Tách đỉnh sinh trƣởng
( Nguồn Viện cây ăn quả miền Nam) Bƣớc 4: Tiến hành vi ghép:
Dụng cụ vi ghép phải đƣợc hấp khử trùng và mọi thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Gốc ghép sau khi đạt tiêu chuẩn ghép thì đƣợc lấy ra đặt vào đĩa petri, cắt bớt phần rễ còn lại khoảng 4cm và từ cổ rễ lên phần thân 2cm. Trên thân ta chọn vị trí ghép và cắt 1 tam giác nhỏ (vị trí đặt mắt ghép).
Chồi ghép (mắt ghép) thu vào đƣợc khử trùng với hypochloride canxi 10% trong 10 phút và rữa lại nƣớc cất 3 lần, sau đó để chồi vào đĩa petri tách bỏ các lá non dƣới kính lúp để lấy đỉnh sinh trƣởng, đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc từ 0,1- 0,2 mm, sau đó đặt đỉnh sinh trƣởng vào vị trí tam giác đã cắt trên gốc ghép.
Cây sau khi vi ghép, đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS lỏng, sao đó đem vào phòng nuôi cây có độ chiếu sáng từ 2500 – 3000lux và nhiệt độ trung bình 250
T
TổổHHợợp Vi Ghp Vi Ghéép Sau 2 Tup Sau 2 Tuầần Tun Tuổổii
Hình 4: Cây vi ghép sau 15 ngày
( Nguồn Viện cây ăn quả miền Nam)
Cây vi ghép thành công và sinh trƣởng tốt có 2-3 lá ( khoảng 45-60 ngày tùy giống), sau đó chuyển qua nơi có nhiệt độ phòng trong 2-4 ngày cho quen dần nhiệt độ trƣớc khi đem ra ghép lần 2
Hình 5: Cây vi ghép 45 ngày tuổi ( Nguồn Viện cây ăn quả miền Nam)
Bƣớc 5: Ghép lần 2:
Cây sau khi vi ghép thành công và đạt tiêu chuẩn ghép lần 2 thì đƣợc đem ra nhà lƣới 2 cửa để tiến hành ghép (gốc ghép đƣợc chuẩn bị sẳn trƣớc 3 – 3,5 tháng).
Hình 6: Nhà lƣới 2 cửa
Phƣơng pháp ghép là ghép nêm, cây ghép xong phải đƣợc đậy kính bằng túi nilon để tránh bị nƣớc tƣới hoặc trời mƣa, vì nhƣ thế mắt ghép sẽ bị thối và chết. Sau khi ghép khoảng 2 tuần thì kiểm tra xem nếu mắt ghép tiếp hợp và phát triển tốt thì có thể tháo bỏ túi nilon và tỉa các chồi dại.
Cây ghép lần 2 thành công và đƣợc 5 tháng trở lên thì ta có thể thu lá để giám định bệnh bằng kỹ thuật PCR, ELISA.
1.2.2. Công nghệ sản xuất cây giống sạch bệnh
- Hệ thống nhà lưới ba cấp
+ Nhà lƣới cấp 1, bảo quản cây giống gốc sạch bệnh (So):
Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trƣởng tạo ra đƣợc các cây So. Những cây giống gốc sạch bệnh So đƣợc giữ và chăm sóc trong nhà lƣới chống côn trùng cấp 1. + Nhà lƣới cấp 2, bảo quản các cây S1 nhân mắt ghép sạch bệnh.
Những cây So cung cấp mắt ghép để ghép lên các gốc ghép thích hợp cho ra các cây S1, những cây này đƣợc bảo quản trong nhà lƣới cấp 2 để nhân hàng loạt
mắt ghép sạch bệnh. Những cây S1 cũng đƣợc giám định bệnh thƣờng kỳ 3 tháng/lần. Những cây dƣơng tính tiếp tục đƣợc loại bỏ. Cây S1 sẽ đƣợc lấy mắt ghép để nhân giống trong 3 năm, sau đó phải thay đợt cây S1 mới.
+ Nhà lƣới cấp 3, sản xuất cây giống sạch bệnh để cung ứng cho sản xuất.
Các mắt ghép sạch bệnh từ các cây S1 đƣợc cung ứng cho các nhà lƣới cấp 3 để sản xuất cây giống sạch bệnh. Gốc ghép sẽ đƣợc chọn sao cho thích hợp với mắt ghép tuỳ theo mục tiêu sản xuất.
Hình 7: Nhà lƣới nhân giống cây có múi
- Quy trình sản xuất cây giống sạch bệnh ở nhà lưới cấp 3.
Chuẩn bị gốc ghép:
+ Chọn giống làm gốc ghép: hiện nay có nhiều giống để chọn làm gốc ghép cho cây có múi. Theo khuyến cáo của các chuyên gia đầu ngành, chúng ta có thể dùng bƣởi chua để làm gốc ghép cho các loại bƣởi, dùng chấp hoặc cam 3 lá để ghép cho các loại cam và quýt.
+ Thành phần nền đất gieo hạt gốc ghép: gồm 1/3 đất màu + 1/3 cát vàng + 1/3 mùn hữu cơ đƣợc hấp khử trùng bằng hơi nƣớc nóng 1000
C trong 60 phút. + Gieo hạt: khoảng cách gieo hạt là 3 x 3 cm. Gieo xong lấp hạt 1 cm bằng đất nhỏ mịn, sau đó dùng ván ấn chặt mặt luống. Tƣới nƣớc đủ ẩm hàng ngày.
+ Chăm sóc cây con: khi cây có 4 lá thật, bắt đầu phun phân bón lá để thúc cây sinh trƣởng khoẻ (dùng loại phân bón lá có các nguyên tố vi lƣợng).
Cây con cao 12 - 15 cm có 5 - 6 lá thật là đủ tiêu chuẩn ra ngôi, cây đƣợc chuyển qua giai đoạn ra ngôi chờ ghép.
+ Kỹ thuật ra ngôi và chăm sóc cây con chờ ghép.
Cây con gốc ghép đƣợc cấy vào các túi bầu polyetylen đựng hỗn hợp nuôi cây.
* Hỗn hợp trong túi bầu ƣơm cây con: Gồm: 1/3 đất màu + 1/3 cát vàng + 1/3 mùn hữu cơ + 100 g/bầu phân NPK.
* Túi bầu: sử dụng túi polyetylen mầu đen, kích cỡ 16 x 35 cm. * Tiêu chuẩn cây gốc ghép:
- Chiều cao cây 40 - 50 cm, đƣờng kính gốc đạt 0,3 cm. - Cây mọc thẳng, khoẻ mạnh, không bị sâu bệnh hại.
Chuẩn bị mắt ghép:
Mắt ghép phải đƣợc lấy từ các cây S1, chỉ dùng mắt thức (mắt đã nổi rõ), không lấy mắt ghép trên cành còn non (cành phải đƣợc 3 tháng tuổi trở lên).
* Phƣơng pháp ghép:
- Ghép theo phƣơng pháp mắt nhỏ có gỗ hoặc ghép nêm. - Vị trí ghép cách mặt bầu 20 cm.
* Thời vụ ghép: cây có múi có thể ghép tốt từ tháng 3 - 10.
Chăm sóc cây con sau ghép:
- Tỉa bỏ chồi mọc ra từ gốc ghép.
- Dùng phân bón lá để nuôi cây trong cả quá trình chăm sóc.
- Phân loại cây con theo từng lô đồng đều về sinh trƣởng để các cây không che khuất lẫn nhau.
- Bấm ngọn tạo tán ngay từ khi chồi ghép cao 20 cm, có 5 - 6 lá, để lại 2 - 3 chồi tạo cành cấp 1 sau này cho cây.
- Thƣờng xuyên kiểm tra sâu bệnh hại để phòng trừ kịp thời.
- Khi cây đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn, phải giám định bệnh cho cây bằng kỹ thuật PCR, ELISA. Cây bệnh đƣợc phát hiện sớm và loại bỏ ngay.
Phƣơng pháp lấy mẫu để giám định bệnh cho các lô cây giống: mỗi mẫu 50 cây, mỗi cây lấy 2 lá bánh tẻ. Nếu mẫu nào dƣơng tính phải thử lại bằng cách chia lô nhỏ hơn, 10 cây/mẫu. Nếu vẫn còn mẫu dƣơng tính phải thử lại từng cây để phát hiện chính xác cây nào đã bị nhiễm bệnh, cây đó phải đƣợc loại bỏ ngay ra khỏi vƣờn.
Khả năng chống chịu bệnh Phytophthora và Tristeza của một số loại gốc ghép cho cây có múi. (By W. W. Ko - Citrus diseases in Malaysia, 1991).
Bảng 1: khả năng chống chịu bệnh của một số giống
Gốc ghép Phytophthora Tristeza
Rough Lemon (chanh sần) - - ++
Citrus Volkameriana + -
Cleopatra mandarin + ++
Sour Orange (Cam chua) ++ - -
Sweet Orange (Cam ngọt) - - +
Poncirus trifoliata (Cam 3 lá) ++ ++
Ghi chú: - Nhiễm trung bình - - Rất nhiễm + Chống chịu trung bình ++ Rất chống chịu