1. Đơn vị đo hoạt độ:
Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thơng tin quan trọng về lượng Enzyme trong đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng. Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được biểu diễn bằng đơn vị Enzyme. Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme cĩ khả năng xúc tác chuyển hĩa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
Trong những điều kiện xác định ( bão hịa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng
Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm Enzyme.
Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyên hĩa bởi I phân tử Enzyme sau 1 phút.
Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên
kết bị phân giải ) được chuyên hĩa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút.
Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyên hĩa hoặc lượng sản phâm phản ứng tạo thành trên I đơn vị thời gian càng lớn.
Bằng cách xác định tốc độ chuyên hĩa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng ta cĩ thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme. Cĩ 3 nhĩm phương pháp:
- _ Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
-_ Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. sản phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
-_ Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong I thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
* Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme cĩ rất nhiều. Ở mỗi nước và mỗi phịng thí nghiệm cĩ thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và thĩi quen. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo phương pháp thống nhất.
2. Xác định hoạt độ Enzyme ơ-Amylase theo Rukhliadeva:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tính bột bởi Enzyme cĩ trong dịch chế phẩm nghiên cứu với các dextrin cĩ phân tử lượng khác nhau. Ðo cường độ màu tạo thành giữa tỉnh
bột và các sản phâm thủy phân của nĩ với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính được hoạt độ Enzyme
Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hĩa được 1 g tỉnh bột tan thành các dextrin cĩ phân tử lượng khác nhau ở 30°C trong thời gian I giờ(_ pH cho Amylase của malt
là 4,8 — 4,9; của nắm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0...)
3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( y-Amylase) d⁄ Phương pháp vỉ lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tính bột bởi Enzyme glucoamylase cĩ trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tính bột tan pHE 4,7 ở nhiệt độ 30°C trong I giờ giải phĩng được I mg glucose. pHE 4,7 ở nhiệt độ 30°C trong I giờ giải phĩng được I mg glucose.
/ Phương pháp sử dụng Enzyme gÌucosilase:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tính bột bởi Enzyme glucoamylase cĩ trong dịch chế phâm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tỉnh bột tan pH = 4,7 ở nhiệt độ 30°C trong thời gian 1 phút giải phĩng được 1 mol glucose.
4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase cĩ hoạt lực cao a4) Chúng giống vi sinh vật:
Muốn nhận chế phẩm Amylase cĩ hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng, giống nào cĩ khả năng tích tụ nhiều Amylase.
Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã cĩ được điều kiện cần thiết để tạo ra chế phẩm Amylase cĩ hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ cĩ tính chất tương đối với thời gian và điều kiện nhất định nào đĩ. Lồi người luơn tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới cĩ hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen.
Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng Asp.awamori T§ - 2 và Asp.awamori 22 cĩ hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu. Asp.awamori T§ - 2 và Asp.awamori 22 cĩ hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu. b) Mơi trường dinh dưỡng:
Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuơi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là mơi trường tự nhiên tốt nhất đề sinh
Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tỉnh bột, 10 - 12% protit. Ngồi ra cịn chứa muối khống, các nguyên tố vi lượng, vitamin...
Để tiết kiệm cám người ta cịn trộn thêm các nguyên liệu khác vào mơi trường như trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia...
Ở nước ta do khơng cĩ cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngơ vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau. ngơ vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau.
Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase cĩ hoạt độ cao từ 4s?.awamori là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngơ 6% ( hàm lượng tỉnh bột 55% ) và 19% trâu.
Hàm lượng tỉnh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuơi cấy là: t°32%C, độ ẩm 57% và
nuơi trong 42 giờ.
Ngồi tỉnh bột, mơi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự cĩ mặt của glucose, fructose và saccarose cĩ tác dụng giúp cho sự phát triển của nắm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào mơi trường lỏng thì nắm mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngồi gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nĩi chung và nắm mốc nĩi riêng đều cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ cĩ thể cĩ sẵn trong cám, bột ngơ, khi cần thiết cĩ thê bổ cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ cĩ thể cĩ sẵn trong cám, bột ngơ, khi cần thiết cĩ thê bổ sung thêm từ khơ lạc, khơ đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxơva, nắm mốc 4s.awøori cĩ thể phát triển tốt trong mơi trường chứa 0,05% đạm vơ cơ nhưng để tạo ø-Amylose thì cần tăng nồng độ tới 0,15%; để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng cĩ tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nắm mốc nhưng ít cĩ hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme. Ví dụ khi bố sung gelatin casein và ngay cả cao ngơ vào canh trường thì việc tích tụ Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vơ cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm mầm vào canh trường lại cĩ tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.
Sự tạo thành và tích tụ Amylase cịn gắn với Sự cĩ mặt của các ion MẸ”, Ca?” và photpho, đặc biệt là magie. Trong mơi trường thiếu MgSOa, Amylase hầu như khơng đc tạo thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đĩng vai trị quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH;¿PO¿a vào khoảng 0,L - 0,2%.
Canxi cĩ trong thành phần của ơ-Amylase. Một phân tử ơ-Amylase cĩ tới 2 hoặc 3 ion canxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi cĩ trong phân tử; nhưng cũng cĩ ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này cịn phụ thuộc vào thành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic.
Lưu huỳnh cũng đĩng vai trị quan trọng khơng kém. Hoạt độ Amylase gắn liền với sự
cĩ mặt của nhĩm —SH; mặt khác cịn tham gia vào thành phần của acid amin cấu tạo thành
Enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo cho hoạt độ Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ Amylase của Asp.orysee chỉ cịn 50% và bằng 180 đv/100ml.
Hoạt độ của một số chúng nuơi trên mơi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt
Hoạt độ dv/g chất khơ Chủng Vi sinh vật
Hoạt độ Amylase | Hoạt độ D Hoạt độ Glu LƠ Hoạt độ Pr
Asp.oryae KC 70.0 450.0 30.0 50.0
Asp.oryae U476 §5.0 665.0 80.0 40.0
Asp.niger S4-I0-III 0.65 437.0 70.0 0.5
ASD.awamori 14.5 850.0 30.0 0
©) Điều kiện nuơi cấy
Chủng giống và mơi trường nuơi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đĩ ta cịn phải chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nắm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm:
« Nhiệt độ
Cần phải cĩ trang bị phù hợp đề duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. Bằng cách quạt khơng khí lạnh và ẩm vào canh trường. Nếu nuơi cấy trong mơi trường lỏng thì cần làm
lạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Nhiệt độ khơng khí trước khi đưa vào phịng nuơi phải vào khống 22 — 25°C, cịn độ
ẩm tương đối của khơng khí là 98 - 100%.
e - Độ ấm canh trường
Trong điều kiện vơ trùng ở phịng thí nghiệm, độ âm tối ưu để nắm mốc phát triển nằm trong giới hạn 65 - 70%. Trong thực tế sản xuất, mức độ vơ trùng khơng thể đạt được như trong phịng thí nghiệm nên người ta thường nuơi cấy trong canh trường cĩ độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ âm cĩ thể khống chế ở 50 - 60%. Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nắm mốc cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo
đài thời gian. Do đĩ vấn đề cần đặt ra là phải bằng mọi biện pháp thực hiện tốt cơng việc vệ
sinh. Muốn vậy trước hết phải tiệt trùng mơi trường ở áp suất và thời gian thích hợp nhằm tiêu diệt các tế bào và bào tử vi sinh vật cĩ sẵn trong nguyên liệu đùng làm mơi trường.
Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển nắm mốc thải ra một lượng nhiệt khá lớn nên canh trường bị nĩng và làm giảm độ ấm. Đồ nước lạnh xuống nền và phun nước quanh tường sẽ gĩp phần giảm nhiệt và giúp cho canh trường đỡ bị khơ.
se pHmơi trường
Khi nuơi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nắm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của mơi trường vào khoảng trưởng và phát triển của nắm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của mơi trường vào khoảng 5,5 - 6,0. pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ Enzyme. Khi nuơi cấy trong mơi trường lỏng: pH ban đầu thường vào khoảng 6 - 7. Đối với Asp.orysee sau 3 ngày nuơi cấy pH giảm cịn 5,5 - 6,0. Ngược lại khi nuơi 4sp.awamori đễ
nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 - 7,8.
Thực tế pH cĩ ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, vì thế trong sản xuất người ta sử dụng acid hoặc amoniac đề điều chỉnh, giữ cho pH luơn trong giới hạn tối ưu.
©e Cung cấp 0xy
Trong quá trình phát triển và tích tụ Enzyme, nắm mốc rất cần oxy. Trong sản xuất sinh học, sự phát triển của tế bào và tích tụ Enzyme cĩ liên quan mật thiết tới sự cĩ mặt của OXy.
Khi nuơi cấy theo phương pháp bề mặt, nắm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của khơng khí qua sợi nắm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nắm mốc tạo nhiều sợi và
tích tụ Enzyme. Nếu mơi trường dính bết, khơng khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra hơ hấp yếm khí,
ảnh hưởng xấu đến tích tụ Enzyme. Vì vậy ở mỗi giai đoạn của sự phát triển, tùy vào lượng oxy cần cho quá trình trao đồi chất và lượng nhiệt nắm mốc tỏa ra mà điều chỉnh lượng khơng khí vào phịng nuơi cho thích hợp.
Yêu cầu về lượng khơng khí và cung cấp oxy trong mơi trường lỏng cĩ những khác biệt. Yêu cầu đặt ra là phải làm sao để oxy của khơng khí hịa tan vào canh trường càng nhiều càng tốt. Trong canh trường lỏng tế bào nắm mốc phân tán trong dịch thẻ, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thơng qua canh trường — khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy cĩ thế hịa tan vào dung dịch. Lượng oxy hịa tan trong canh trường phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, áp suất, cơng nghệ sục khí cũng như hàm lượng và tính chất của các chất hịa tan trong dung dịch.