Tiến hành chiết tách DNA tổng số bằng bộ kit DNeasy Blood & Tissue Kit, quy trình chiết tách được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Qiagen).
Nguyên tắc:
Kit sử dụng hệ thống buffer được tối ưu để ly giải trực tiếp tế bào và dùng màng lọc có Silicagel gắn kết có chọn lọc với DNA. Đầu tiên, mẫu được ly giải trong điều kiện biến tính cao để ly giải tế bào và phân huỷ protein. Sau đó mẫu được chuyển qua cột lọc DNeasy Mini spin, qua quá trình ly tâm, DNA được gắn kết vào màng một cách chọn lọc. Các tạp chất còn lại được loại bỏ trong 2 bước rửa với dung dịch đệm để rửa khác nhau. DNA được hoà tan lại bằng dung dịch đệm phù hợp (Hình 2.1).
* Quy trình
Hình 2.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số Histomonas meleagridis từ mẫu nội tạng
* Tiến hành tách chiết DNA tổng số từ mẫu nội tạng - Ly giải: Gắn kết lên cột lọc Mẫu Ly giải Rửa Hoà tan DNA
38
+ Cắt nhỏ 25 mg mẫu nội tạng (gan, manh tràng) của gà nghi nhiễm Histomonas meleagridis cho vào ống Eppendorf, cho thêm 180 µl buffer ATL vào huyễn dịch mẫu, thêm 20 µl proteinase K. Vortex nhẹ, sau đó ủ ở 56oC (1 – 3 giờ) trong bể điều nhiệt cách thuỷ đến khi mô được phân huỷ hoàn toàn.
+ Vortex nhẹ trong 15 giây. Thêm 200 µl buffer AL vào mỗi mẫu, vortex nhẹ. Sau đó thêm 200 µl ethanol 96o và vortex.
- Gắn kết lên cột lọc:
+ Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống có màng lọc Dneasy (mini colum). Sau đó ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dưới, giữ lại phần cột có màng lọc.
- Rửa:
+ Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm. + Thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm 12000 vòng trong 3 phút, bỏ dịch ly tâm.
- Hoà tan:
+ Lấy cột đặt vào ống eppendorf 1,5 ml mới có ghi ký hiệu của mẫu. Thêm 200 µl buffer AE. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống eppendorf.
+ Dịch ly tâm chính là DNA tổng số, bảo quản ở -20oC.
* Tách chiết DNA tổng số từ mẫu phân
- Nhỏ 25 µl dung dịch phân lên tấm giấy FTA® Classic indicating Card, mỗi vòng tròn tấm giấy nhỏ một mẫu phân. Để khô khoảng 1 giờ đồng hồ ở nhiệt độ phòng. Ghi số mẫu lên mỗi tấm giấy.
- Dùng bấm đục lỗ đường kính 1,4 mm, lấy vòng trong giấy vừa đục xong cho vào tube PCR.
- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa FTA Purification Reagent, mỗi lần rửa dùng 200 µl dung dịch FTA và để dung dịch tác động 5 phút sau mỗi lần rửa.
- Rửa 2 lần bằng dung dịch TE 1x, mỗi lần rửa dùng 200 µl dung dịch FTA và để dung dịch tác động trong 5 phút sau mỗi lần rửa. Để khô trong không khí (60 phút) và tiến hành chạy PCR.