1.7.3.1. Xét nghiệm tiêu bản
Xét nghiệm tiêu bản tìm Histomonas meleagridis đòi hỏi phải có kính hiển vi với độ tương phản tốt, sử dụng các mẫu vật tươi từ các loài gia cầm vừa bị giết chết trong phòng thí nghiệm. Đơn bào Histomonas meleagridis và các Trophozoite dễ dàng được quan sát sơ bộ bằng phương pháp soi tươi và nhuộm.
- Xét nghiệm tìm đơn bào Histomonas meleagridis bằng cách soi tươi (Soi trực tiếp):
Làm tiêu bản phân, niêm mạc manh tràng, mô gan và quan sát trực tiếp trên kính hiển vi ở độ phóng đại 100 – 400 lần. Khi soi tươi có thể quan sát được các hình dạng,
21
kích thước của đơn bào Histomonas meleagridis và trứng giun kim Heterakis gallinarum.
- Nhuộm Lugol hoặc Hematoxylin các tiêu bản đã soi trực tiếp và soi dưới kính hiển vi để quan sát đặc điểm hình dạng, kích thước của Histomonas meleagridis. Đây là phương pháp truyền thống, quá trình kiểm tra rất nhanh tuy nhiên dễ bỏ sót
Histomonas meleagridis khi quan sát (Zaragatzki và cộng sự, 2010).
1.7.3.2. Nuôi cấy
Có một số yếu tố cần thiết cho việc nuôi cấy thành công Histomonas meleagridis. Theo McDougald (2005), Histomonas meleagridis phát triển trong môi trường kỵ khí. Ngoài ra, sự có mặt của thuốc kháng sinh trong môi trường nuôi cấy sẽ làm giảm sự phát triển của các vi khuẩn khác, trong khi Histomonas meleagridis vẫn tăng trưởng.
Người đầu tiên nuôi cấy Histomonas meleagridis là Drbohlav (1924) đã báo cáo rằng lòng trắng đã đông của trứng được bao phủ bởi huyết tương có chứa 1% peptone tốt hơn so với dùng thạch máu cùng với dung dịch Locke’s hoặc chỉ dùng môi trường trứng đã đông với dung dịch Locke’s . Drbohlav cho thấy, tăng trưởng của Histomonas meleagridis tốt nhất ở độ pH 7,2 - 7,8. Ngoài Drbohlav (1924) ra, các tác giả khác như Tyzzer (1934) và Bishop (1937) cũng nuôi cấy Histomonas meleagridis trên môi trường chứa bột gạo và 5% huyết thanh ngựa tuy nhiên kết quả chưa được thành công (McDougald, 2002).
De Volt (1943) đã nghiên cứu phát triển môi trường khác đơn giản và dễ dàng chuẩn bị hơn, thành phần môi trường bao gồm: 2% huyết thanh gà tây và 2% dung dịch Locke’s, hấp ở 120oC trong 20 phút, trước khi sử dụng mỗi ống được bổ sung thêm một chút tinh bột gạo vô trùng. Kết quả cho thấy, Histomonas meleagridis chỉ tồn tại ở mức độ cộng sinh. Sau đó, nhiều thử nghiệm khác nhau để thay thế các thành phần của DeVolt như thay huyết thanh bằng kem tươi, thay kem tươi bằng sữa bò tươi...nhưng đều không cho kết quả tốt. Lesser (1960) sau này đã pha loãng môi trường M199 10 lần với nước cất và bổ sung 10% kem đã lọc hoặc huyết thanh cừu hoặc ngựa cùng với 0,05% NaHCO3; ngoài ra còn bổ sung thêm este cholesterol, các sterate và palmitate hỗ trợ tăng trưởng Histomonas meleagridis, tuy nhiên kết quả vẫn
22
không được cải thiện, Histomonas meleagridis vẫn tăng trưởng nhưng phát triển chậm với số lượng ít (McDougald, 2002).
Tới năm 1970, Dwyers đã phát triển môi trường nuôi cấy Histomonas meleagridis thành công nhất và được điều chỉnh bởi McDougald và Galloway (1973). Thành phần môi trường bao gồm: 85 - 95% môi trường M199, 5% dịch chiết từ phôi gà, 10% huyết thanh cừu hoặc huyết thanh ngựa, 1% bột gạo và điều chỉnh pH 7,8. Cũng trong thời gian này, Dwyers đã tối ưu hoá môi trường trên với thành thần bột gạo giảm xuống 0,8% và loại bỏ phôi gà. Kết quả cho thấy số lượng Histomonas meleagridis tăng gấp gần 10 lần. Histomonas meleagridis có thể phát triển rất nhanh trong môi trường Dwyer từ 2 đến 5 ngày và sau đó giảm dần vì nguồn dinh dưỡng cạn kiệt và do tạo thành nhiều chất độc. Môi trường này đã và đang được ứng dụng trên thế giới để nghiên cứu Histomonas meleagridis (McDougald, 2002).
Trong quá trình nuôi cấy Histomonas meleagridis thường bị nhiễm loại đơn bào phát triển rất tốt trong môi trường Dwyer và cạnh tranh với Histomonas meleagridis
gọi là Blastocystis. Blastocystis tương tự như tảo đỏ và không bị ức chế bởi thuốc kháng sinh hoặc thuốc kháng nấm, đây cũng là khó khăn trong quá trình nuôi cấy
Histomonas meleagridis (McDougald, 2002).
1.7.3.3. Kỹ thuật PCR
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt. Phương pháp cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao (Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2010).
Trong lịch sử để chẩn đoán Histomonas meleagridis ngoài dựa trên phương pháp xét nghiệm và mổ khám thì trong vòng nhiều năm trở lại đây việc sử dụng phản ứng PCR đã được chứng minh thành công trong việc phát hiện Histomonas meleagridis
(Hafec và cộng sự, 2005).
1.8. Một số biện pháp phòng và trị bệnh 1.8.1. Phòng bệnh
23
Không được nuôi chung gà Tây với gà ta vì gà ta thường chứa một lượng lớn giun kim và trứng giun kim nên gà Tây có thể bị nhiễm nghiêm trọng. Phải chú ý đến mật độ và các thông số nhiệt độ, độ ẩm và khí độc chuồng vì khả năng tồn tại của các trứng Heterakis gallinarum có thể được giảm bớt bằng cách chiếu ánh sáng mặt trời và trong điều kiện khô thoáng tốt. Các biện pháp khử trùng tẩy uế chuồng có thể có tác dụng tiêu diệt trứng giun nhưng hiện nay chưa có nhiều số liệu liên quan đến biện pháp này.
Chăn nuôi gà trong nhà cũng là một biện pháp có thể làm giảm tỷ lệ mắc bệnh Đầu đen vì loại bỏ được nguồn nhiễm bệnh từ việc ăn giun đất. Hàng ngày quan sát vùng da, đầu mép, mào và tích…để kịp thời phát hiện và điều trị ngay khi chưa thành dịch.
Từ 20 ngày tuổi trở lên hàng tuần trong nước uống cần bổ sung CuSO4 hoặc mỗi tuần một lần cho uống KMnO4 pha với tỷ lệ (một phần vạn) tức 1 g thuốc tím pha với 10 lít nước cho uống trong vòng 1 – 2 h/ngày/đợt.
Sân vườn thường xuyên phải cuốc xới, rắc vôi bột tốt nhất là 2 tuần làm một lần. Đường đi lối lại cũng phải rắc, trước cửa chính phải có hố sát trùng (Nguyễn Hữu Nam và cộng sự, 2013).
1.8.2. Trị bệnh
Điều trị bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis được nghiên cứu từ những năm 1950 với nhiều phương pháp khác nhau để kiểm soát bệnh và một số hợp chất hóa học đã được thử nghiệm điều trị bệnh Đầu đen thành công.
Năm 1960 các hợp chất arsen, nitroheterocyclic và một số chất khử trùng khác nhau được sử dụng để chống lại Histomonas meleagridis. Một số vitamin và các hợp chất dinh dưỡng khác cũng được cho là có ảnh hưởng đến Histomonas meleagridis (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Whitmore và cộng sự, 1968).
Trước đây nhiều loại hoá chất đã được thử nghiệm chống lại Histomonas meleagridis ở điều kiện in vitro và in vivo như enheptin, các hợp chất của
nitroimidazoles như dimetridazole, ipronidazole, ronidazole và các hợp chất của arsen cho thấy có hiệu quả (Bowen và cộng sự, 1971; Grumbles, 1952). Tuy nhiên nhóm
24
thư và hợp chất của arsen cũng đã bị cấm ở Liên minh châu Âu vì độc tính của arsen (Flowers và cộng sự, 1965).
Hiện nay, nitarsone là hoá dược duy nhất thuộc nhóm hợp chất arsen được sử dụng trong thức ăn với liều lượng 187,5 ppm và rất thành công trong việc kiểm soát sự phát triển của Histomonas meleagridis (Huber, 2005). Ngoài nitarsone còn có các
nitromidazoles (dimetridazole, ipronidazole hoặc ronidazole) có hiệu quả cao cho công tác phòng, chữa bệnh ở gà. Các hoá dược này vẫn được sử dụng ở một số nước.
Furazolidone cũng được sử dụng để điều trị bệnh Đầu đen nhưng không được sử dụng ở Hoa Kỳ và Việt Nam (Grumbles, 1952).
(Ghi chú: Theo Thông tư 15/2009/TT-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Dimetridazole thuộc danh mục cấm sử dụng trong thú y)
Gần đây, ảnh hưởng của nifurtimox và tiamulin đã được nghiên cứu để điều trị
Histomonas meleagridis. Tiamulin được biết đến là pleuromutilin bán tổng hợp, tiamulin ức chế mạnh tiểu đơn vị 50S ribosome của vi khuẩn thông qua ức chế mạnh enzyme pepitdyl transferase trong ribosome. Các nghiên cứu cho thấy là Tiamulin tác dụng lên ký sinh trùng trong nghiên cứu in vivo và những kết quả gần đây thử nghiệm trên đàn gia cầm bị nhiễm Histomonas meleagridis đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong gia cầm (Hauck và cộng sự, 2010a, 2010b).
Hoá dược nifurtimox (Nfx) dưới dạng biệt dược (tên thương mại) là Lampit và Bayer A-2502 được biết đến là thuốc được sử dụng ở người để điều trị chống lại bệnh Chagas. Nfx là một hợp chất mạch vòng của nitro và gần đây nó đã được sử dụng thành công để chống lại Histomonas meleagridis. Nghiên cứu cho thấy nifurtimox với liều lượng 200 hoặc 400 ppm trong thức ăn làm giảm tỷ lệ tử vong gà nhiễm
Histomonas meleagridis, ở nồng độ 12,5 – 100 ppm chỉ làm chậm sự tăng trưởng của
Histomonas meleagridis trong 48 giờ. Đồng thời, nifurtimox cũng làm giảm tổn thương gan do Histomonas meleagridis nhưng có tác dụng ít hơn đối với tổn thương manh tràng (Hauck và cộng sự, 2010a).
1.9. Giới thiệu phản ứng PCR 1.9.1. Định nghĩa
25
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – Phản ứng khuếch đại gen), đây là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không cần tạo dòng (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003).
Trong lịch sử, chẩn đoán Histomonas meleagridis dựa trên phương pháp mổ khám và quan sát kính hiển vi. Tuy nhiên, trong vòng vài năm trở lại đây, việc sử dụng phản ứng PCR đã được chứng minh thành công trong việc phát hiện Histomonas meleagridis (Hafec và cộng sự, 2005; Huber và cộng sự, 2005).
1.9.2. Nguyên lý
Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng lớn bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này (Lê Thị Thúy Dung, 2013).
Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Biến tính, gắn mồi và kéo dài (Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2010).
Để phát hiện Histomonas meleagridis kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi của Huber và cộng sự (2005):
HIS5F: 5’ – CCTTTAGATGCTCTGGGCTG – 3’ HIS5R: 5’ – CAGGGACGTATTCAACGTG – 3’
26
Hình 1.7. Nguyên tắc phản ứng PCR
(Triệu Nguyên Trung và Huỳnh Hồng Quang, 2010)
Trong chẩn đoán bệnh Đầu đen do Histomonas meleagridis, kỹ thuật PCR sử dụng mồi đặc hiệu cho Histomonas meleagridis, cặp mồi được sử dụng dựa trên vùng 18S trên rRNA (Huber và cộng sự, 2005).
rDNA là nhóm gen mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu phát sinh loài. rDNA được nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá, phần lớn rDNA tương đối bảo tồn nên là cơ sở dể tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau (Lại Hà Tố Hoa, 2006).
Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo tồn được sử dụng cho tất cả các sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương được so sánh (Lại Hà Tố Hoa, 2006). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
rDNA chứa các vùng 18S, 5,8S và 28S, các vùng này phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS – Internal transcribed spacer) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS – External transcribed spacer) (Lại Hà Tố Hoa, 2006).
Gen 18S rRNA thường được quan tâm nghiên cứu vì có trình tự bảo tồn cao và thường sử dụng trong thiết kế mồi trong các nghiên cứu phân loại. Nhiều nghiên cứu cho thấy vùng 18S rRNA là chỉ thị phân tử hiệu quả cho các nghiên cứu về tiến hoá của ký sinh trùng (Huber và cộng sự, 2005).
27
Hầu hết các nghiên cứu về Histomonas meleagridis đã tập trung vào vùng 18S của ribosome tiểu đơn vị nhỏ để thiết kế mồi và xác định sự hiện diện của Histomonas meleagridis trong mẫu mô, cặp mồi được thiết kế để khuếch đại vùng có kích thước khoảng 209 bp (Bart và cộng sự, 2008; McDougald, 2010).
Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose để phát hiện các đoạn DNA đặc thù hoặc các đoạn DNA bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp). Nồng độ phần trăm agarose trong gel phụ thuộc vào kích thước phân đoạn DNA (Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2010).
1.9.3. Một số yếu tố ảnh hưởng và giải pháp tối ưu hoá phản ứng PCR
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự thành công của phản ứng PCR bao gồm các thành phần tham gia phản ứng (DNA khuôn mẫu, enzyme DNA polymerase, mồi và nhiệt độ lai, nồng độ dNTP, dung dịch đệm, nước) và các thành phần khác như số lượng chu kỳ phản ứng, thiết bị và dụng cụ phản ứng (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003; Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2010)
1.9.3.1. DNA khuôn mẫu
Phản ứng PCR xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1 µg xuống còn 100 ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003).
Nồng độ tối ưu DNA mẫu:
+ Đối với mẫu DNA tương đối đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA) là 1 pg – 10ng/50µl tổng thể tích phản ứng.
+ Đối với mẫu DNA genome thì từ 50 – 500 ng/50µl tổng thể tích (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003; Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2010).
1.9.3.2. Enzyme DNA polymerase
Nồng độ enzyme phụ thuộc vào lượng DNA mẫu và kích thước sản phẩm PCR. Nồng độ enzyme quá cao có thể xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai lệch kết quả. Ngược lại, nồng độ enzyme DNA polymerase quá thấp sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2003)
28
Nồng độ enzyme thích hợp là từ 1 – 2,5 unit cho 100 µl dung dịch phản ứng. Thông thường có thể sử dụng 0,5 unit/25 µl (Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2010).
1.9.3.3. Primer và nhiệt độ lai
Việc lựa chọn primer (mồi) cần tuân thủ một số quy tắc, đối với genome của eukaryote thường dùng các primer dài khoảng 18 nucleotide trở lên. Tuy nhiên, cũng tuỳ từng trường hợp, có những primer của các chỉ thị phân tử ngẫu nhiên như RAPD rất ngắn hoặc STS cần primer dài hơn. Nói chung, tuỳ theo loài sinh vật và tuỳ theo cách thể hiện của trình tự DNA khuôn mẫu (Lê Thị Thúy Dung, 2013).
Trong hầu hết các ứng dụng của PCR, hai primer F và R đều phải có nồng độ bằng nhau. Nồng độ cuối cùng của mỗi primer là 0,1 µM trong 25 µl dung dịch phản ứng (Nguyễn Hoàng Lộc, 2010).
1.9.3.4. Nồng độ dNTP
dNTP là nguyên liệu tạo nên mạch DNA mới (gồm bốn loại dATP, dTTP, dGTP và dCTP) hiệu (Nguyễn Hoàng Lộc, 2010).
Dung dịch stock của các dNTP phải có pH = 7, nồng độ thường dùng là 10 mM (2,5 mM mỗi loại dNTP) được bảo quản ở -20oC. Nồng độ của các dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, chính xác và đặc hiệu (Nguyễn Hoàng Lộc, 2010).
1.9.3.5. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 Mm và MgCl2
21.5 mM. Ngoài ra còn có thể chứa 0,001% BSA hay Gelatin và trong một số phản ứng PCR còn có thêm Tween. Trong các thành phần đó, MgCl2 (Mg2+) có ảnh hưởng nhiều nhất tới phản ứng PCR.Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme DNA polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch kép (Nguyễn Hoàng Lộc, 2010).
Nồng độ thích hợp của Mg2+ là từ 0,5 – 2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số đã cho. Nồng độ Mg2+ tối ưu sẽ đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm PCR (Nguyễn Hoàng Lộc, 2010).
29
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào. Không được chứa các enzyme cắt hạn chế DNA (endonuclease), không chứa enzyme phân huỷ DNA (DNase), phân huỷ RNA (RNase). Ion lạ sẽ ảnh hưởng nồng độ dung dịch đệm trong phản ứng, các loại enzyme sẽ phân huỷ hay cắt bỏ DNA làm khuôn hoặc sản phẩm PCR (Lê Thị Thúy Dung, 2013).
1.9.3.7. Nhiệt độ của quá trình ủ
Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó có ½ primer gắn với DNA mẫu. Công thức dưới đây áp dụng trong trường hợp primer có khoảng 20 oligonucleotide : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ta = 4(G + C) + 2(A + T) – 5oC
Số base của primer càng ít thì nhiệt độ này càng thấp và ngược lại (Hồ Quỳnh