1.9.4.1. Ưu điểm
30
- Đơn giản và ít tốn kém: Được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với mẫu nucleic acid thô như mẫu máu hay các dấu vết trong phân tích pháp y.
- Có thể phát hiện những vi khuẩn khó nuôi cấy. Việc tăng sinh là đơn giản hoặc không cần thiết.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hoá để làm giảm chi phí phát hiện sinh vật gây bệnh (Lê Thị Thúy Dung, 2013).
1.9.4.2. Nhược điểm
- Kích thước của trình tự cần khuếch đại: Phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb.
- Sự ngoại nhiễm từ các sản phẩm khuếch đại của những lần trước (Lê Thị Thúy Dung, 2013).
31
Chương 2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo của Histomonas meleagridis.
- Nghiên cứu vòng đời của Histomonas meleagridis.
- Nghiên cứu xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh do Histomonas meleagridis ở gà.
- Nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể của bệnh do Histomonas meleagridis ở gà.
- Chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR.
2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm, động vật thí nghiệm
- Mẫu bệnh phẩm:
Mẫu gan, manh tràng, phân của gà ở các lứa tuổi nghi bệnh do Histomonas meleagridis.
- Động vật thí nghiệm: Gà thí nghiệm từ 1 – 3 tháng tuổi.
2.2.2. Hóa chất- sinh phẩm
- Dung dịch Formol 10%; nước cất; môi trường M199; huyết thanh ngựa ; bột gạo; kháng sinh Penicillin và Streptomycin;
- Bộ Kit chiết tách DNA từ mẫu gan và manh tràng (Qiagen Dneasy Blood & Tissue Kit) bao gồm: Buffer ATL, buffer AL, proteinase K, buffer AW1 và AW2 buffer AE, Ethanol tuyệt đối (pure);
- Bộ Kit chiết tách DNA từ mẫu phân: Dung dịch FTA, dung dịch TE, giấy FTA®
Classic indicating Card;
- Hoá chất chạy PCR: PCR Master Mix Kit, cặp mồi: HIS5F – HIS5R, nước tinh khiết;
- Hoá chất chạy điện di: Agarose, dung dịch đệm TBE, Ethydium Bromide, Loading Dye 6X và DNA Ladder 100 bp.
32
2.2.3. Máy móc, thiết bị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Micropipet, đầu típ các loại; - Dao, pank, kẹp, kéo;
- Cốc thủy tinh, ống Eppendorf, ống Falcon; - Lam kính, lamen;
- Bấm đục lỗ khoanh giấy;
- Máy ly tâm lạnh VSAID Centrifuge 5415R (Eppendorf, Đức), máy vortex MS3 (IKA, Đức), máy luân nhiệt Mastercycler pro S (Eppendorf, Đức), lò vi sóng (Sanyo, Nhật Bản);
- Bộ điện di ngang MiniGel XL (Apelex, Pháp), máy đọc gel GelDoc (Biorad, Mỹ);
- Kính hiển vi quang học (Olympus CH2);
- Cân phân tích Adventurer Pro (Ohaus, Mỹ), cân điện tử; - Bể điều nhiệt cách thuỷ NB301L (N-BIOTEK, Hàn Quốc); - Tủ lạnh SR-20KN (Sanyo, Nhật Bản), tủ ấm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
* Địa điểm thu mẫu
Mẫu được thu tại một số địa điểm thuộc huyện Cam Ranh và Ninh Hòa – Nha Trang – Khánh Hòa.
* Số lượng mẫu
Thu tổng số 130 mẫu, trong đó huyện Cam Ranh lấy 65 mẫu và huyện Ninh Hòa lấy 65 mẫu.
* Đối tượng
- Vừa tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên và lấy mẫu theo phương pháp chọn lọc. + Đối với lấy mẫu theo phương pháp chọn lọc: Lấy gà có một trong những triệu chứng lâm sàng như ủ rủ, rúc đầu vào cánh, đứng dang rộng chân, sã cánh, xù lông, bỏ ăn, sốt cao 43 – 44oC; tiêu chảy phân màu cà phê, hồng lẫn máu, về sau phân loãng màu đục như nước vo gạo; đặc biệt, vài ngày sau gà có triệu chứng đặc trưng như da mép, da vùng đầu, mào nhanh chóng có màu xám xanh rồi chuyển sang xanh đen.
33
* Loại mẫu
Mẫu phân và nội tạng (manh tràng và gan) của gà ở các lứa tuổi.
* Bảo quản mẫu
- Mẫu phân bảo quản trong dung dịch TBE 1x.
- Mẫu nội tạng được thu và cho vào tube đặt trong thùng đá lạnh
- Các mẫu bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong tube đặt trong thùng đá lạnh và vận chuyển tới phòng xét nghiệm trong thời gian 48 h.
- Ghi nhãn các nội dung mẫu bệnh phẩm: Chủ gia cầm, số bệnh phẩm, ngày tháng lấy, địa điểm, thời gian, lứa tuổi...
2.3.2. Nghiên cứu xác định các đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học của
Histomonas meleagridis
2.3.2.1. Phương pháp xét nghiệm tiêu bản
Xét nghiệm tìm Histomonas meleagridis bằng cách làm tiêu bản phân, niêm mạc manh tràng, mô gan.
- Cách làm tiêu bản phân
Lấy một mẫu phân bằng hạt đỗ cho lên lam kính, nhỏ thêm 1 giọt nước cất, dùng góc lam kính đánh tan mẫu phân, sau đó gạt đều huyễn dịch phân ra 2 đầu phiến kính, đậy lamen lên và soi tiêu bản dưới kính hiển vi độ phóng đại 100 - 400 lần.
- Cách làm tiêu bản mô gan
Đặt mẫu gan bằng hạt đỗ cho lên lam kính, dùng đũa thủy tinh đánh tan mẫu, phần xác mô gan gạt bỏ ra ngài và nhỏ thêm 1 giọt nước cất, dùng lam kính dàn đều mẫu ra hai đầu phiến kính, đậy lamen và soi dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 – 400 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cách làm tiêu bản niêm mạc manh tràng
Đặt mẫu manh tràng lên đĩa petri sạch, dùng bằng pank và kéo sạch cắt dọc theo manh tràng, rửa sạch chất chứa trong manh tràng bằng nước cất. Sau đó nạo lớp niêm dịch cho lên lam kính nhỏ thêm 1 giọt nước cất, dùng lam kính dàn đều mẫu ra hai đầu phiến kính, đậy lamen và soi dưới kính hiển vi độ phóng đại 100 - 400 lần.
2.3.2.2. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường Dwyer
34 + Môi trường M199 : 9 ml
+ Huyết thanh ngựa : 1,3 ml + Bột gạo : 11 mg
+ Bổ sung 2000 IU kháng sinh Penicillin và 2000 µg Streptomycin.
- Môi trường nuôi cấy được hút và cho vào các ống nghiệm đã chuẩn bị vô trùng sẵn có nắp đậy kín và đánh số thứ tự.
- Dùng pank và kéo sạch cắt một mẫu gan, manh tràng gà nghi nhiễm
Histomonas meleagridis cho vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy, để trong tủ ấm ở 40oC trong 48 h.
- Sau 48 h nuôi cấy, dùng pipet hút một giọt dung dịch nuôi cấy cho lên phiến kính để xét nghiệm tìm Histomonas meleagridis:
+ Đếm số lượng đơn bào Histomonas meleagridis bằng buồng đếm hồng bạch cầu Neubauer.
+ Quan sát hình dạng, kích thước và cấu tạo của đơn bào bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 100 – 400 lần.
2.3.3. Phương pháp xác định vòng đời của Histomonas meleagridis
2.3.3.1. Xác định quá trình phát triển của Histomonas meleagridis trong trứng giun kim ở môi trường bên ngoài giun kim ở môi trường bên ngoài
- Thu thập trứng giun kim Heterakis gallinarum từ phân và manh tràng của gà bị bệnh do Histomonas meleagridis.
- Cho trứng giun kim lên đĩa Petri, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (22 – 25oC). - Hàng ngày lấy mẫu xét nghiệm để theo dõi các giai đoạn phát triển phôi bào của trứng giun kim cho đến khi hình thành ấu trùng.
- Xác định sự hiện diện của Histomonas meleagridis có trong trứng giun kim qua kính hiển vi và bằng kỹ thuật PCR.
2.3.3.2. Xác định quá trình phát triển của Histomonas meleagridis trong cơ thể gà
- Xác định quá trình phát triển của Histomonas meleagridis trong cơ thể gà được bố trí trên 3 lô thí nghiệm. Gà thí nghiệm được chọn là gà 1 – 3 tháng tuổi không nhiễm trứng giun kim Heterakis gallinarum và đơn bào Histomonas meleagridis.
35
+ Để xác định gà thí nghiệm có bị nhiễm trứng giun kim Heterakis gallinarum
và đơn bào Histomonas meleagridis hay không tiến hành xét nghiệm trứng giun kim bằng phương pháp phù nổi Fulleborn; xét nghiệm Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR.
- Phương pháp phù nổi Fulleborn:
Nguyên lý: Lợi dụng tỷ trọng của một số dung dịch lớn hơn tỷ trọng của trứnggiun, làm cho trứng nổi lên. Ví dụ dung dịch nước muối bão hoà (NaCl), dung dịch Sodium hyposulfat, dung dịch đường glucose.
+ Chuẩn bị dung dịch NaCl: Cân 380 g NaCl cho vào 1000 ml nước sôi và dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều đến khi muối không tan được nữa. Để nguội và lọc qua vải màn để loại bỏ cặn và lớp muối kết tinh.
+ Lấy 5 – 10 g phân gà cần kiểm tra vào một cốc thuỷ tinh nhỏ, dung đũa thuỷ tinh khuấy nát phân trong 50 ml dung dịch NaCl bão hoà. Sau đó lọc qua lưới lọc để loại bỏ bã cặn, dung dịch lọc thu được để yên tĩnh trong cốc.
+ Sau khoảng 15 – 30 phút trứng sẽ nổi lên nếu có. Dùng vòng vớt thép đường kính 5 mm vớt lớp váng ở phía trên, để lên lam kính, đậy lamen và quan sát tìm trứng giun dưới kính hiển vi.
- Bố trí thí nghiệm gây nhiễm Histomonas meleagridis trên gà:
+ Lô 1: Gây nhiễm 40 con gà bằng trứng giun kim Heterakis gallinarum (có chứa Histomonas meleagridis) chưa hình thành ấu trùng với liều là 1000 trứng giun kim/gà qua đường miệng.
+ Lô 2: 40 con gà được gây nhiễm trứng giun kim Heterakis gallinarum (có chứa Histomonas meleagridis) đã hình thành ấu trùng với liều 1000 trứng giun kim/gà bằng đường miệng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lô 3: 20 con gà đối chứng, không gây nhiễm.
- Xác định gà bị bệnh do Histomonas meleagridis qua theo dõi triệu chứng lâm sàng, bệnh tích. Sau 2 tuần gây nhiễm, lấy mẫu phân hàng ngày để xét nghiệm bằng phương pháp phù nổi Fulleborn và phương pháp PCR.
2.3.4. Nghiên cứu xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh do
Histomonas meleagridis gây ra
36
- Tiến hành xác định triệu chứng lâm sàng trên gà thực địa và gà được gây nhiễm trong điều kiện thí nghiệm. Quan sát trực tiếp, ghi chép, thống kê các biểu hiện của gà khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng, triệu chứng lâm sàng (trạng thái, ăn uống, màu sắc mào, màu sắc phân, nhiệt độ cơ thể).
* Phương pháp mổ khám và xác định bệnh tích
Mục đích: Xác định các biến đổi bệnh tích đại thể và vi thể các cơ quan nội tạng nghi mắc bệnh do Histomonas meleagridis .
Tiến hành mổ khám gia cầm theo Nguyễn Hữu Nam và cộng sự (Tài liệu tiêu chuẩn ngành – Cục thú y, 2006) như sau:
Chuẩn bị mổ khám: Chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ đã được vô trùng, hoá chất và trang thiết bị cần thiết cho quá trình mổ khám và cho người mổ khám.
Tiến hành mổ khám:
- Đối với gia cầm còn sống quan sát từ ngoài vào trong, kiểm tra từng cơ quan riêng biệt, ghi lại những biến đổi từ ngoài vào trong vào biên bản mổ khám.
- Đối với gia cầm chết tiến hành mổ khám theo trình tự sau:
+ Đặt gia cầm nằm ngửa trên bàn mổ, cắt da giữa xoang vùng bụng và vùng bẹn hai bên chân, rồi lật chân sang hai bên.
+ Cắt da vùng giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái lên tận diều bộc lộ vùng cơ ngực. + Dùng kéo rọc da từ giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, cắt tiếp lên phía trên hai bên sụn qua xương đòn, xương quạ, loại những tổ chức dính và nhấc bỏ xương lưỡi hái ra ngoài bộc lộ xoang ngực, xoang bụng.
+ Quan sát các túi khí và phía ngoài cơ quan nội tạng.
+ Lấy các cơ quan, bộ phận nội tạng (gan, manh tràng) dùng cho xét nghiệm. + Kiểm tra các cơ quan nội tạng khác như tim, gan, lách, thận , phổi....
+ Dùng kéo rạch một đường từ dạ dày tuyến xuống tận hậu môn kiểm tra các thương tổn, xuất huyết hoại tử ở đường tiêu hóa.
- Đọc tiêu bản bệnh tích vi thể
Từ những mẫu có biến đổi đại thể, bảo quản Formol 10% để làm tiêu bản vi thể. Làm tiêu bản vi thể theo quy định tẩm, đúc paraffin, cắt mẫu bằng máy Microtom, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE), gắn tiêu bản và soi tiêu bản trên kính hiển vi quang học.
37
2.3.5. Phương pháp chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện đơn bào Histomonas meleagridis.
2.3.5.1. Chiết tách DNA
Tiến hành chiết tách DNA tổng số bằng bộ kit DNeasy Blood & Tissue Kit, quy trình chiết tách được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Qiagen).
Nguyên tắc:
Kit sử dụng hệ thống buffer được tối ưu để ly giải trực tiếp tế bào và dùng màng lọc có Silicagel gắn kết có chọn lọc với DNA. Đầu tiên, mẫu được ly giải trong điều kiện biến tính cao để ly giải tế bào và phân huỷ protein. Sau đó mẫu được chuyển qua cột lọc DNeasy Mini spin, qua quá trình ly tâm, DNA được gắn kết vào màng một cách chọn lọc. Các tạp chất còn lại được loại bỏ trong 2 bước rửa với dung dịch đệm để rửa khác nhau. DNA được hoà tan lại bằng dung dịch đệm phù hợp (Hình 2.1).
* Quy trình
Hình 2.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số Histomonas meleagridis từ mẫu nội tạng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Tiến hành tách chiết DNA tổng số từ mẫu nội tạng - Ly giải: Gắn kết lên cột lọc Mẫu Ly giải Rửa Hoà tan DNA
38
+ Cắt nhỏ 25 mg mẫu nội tạng (gan, manh tràng) của gà nghi nhiễm Histomonas meleagridis cho vào ống Eppendorf, cho thêm 180 µl buffer ATL vào huyễn dịch mẫu, thêm 20 µl proteinase K. Vortex nhẹ, sau đó ủ ở 56oC (1 – 3 giờ) trong bể điều nhiệt cách thuỷ đến khi mô được phân huỷ hoàn toàn.
+ Vortex nhẹ trong 15 giây. Thêm 200 µl buffer AL vào mỗi mẫu, vortex nhẹ. Sau đó thêm 200 µl ethanol 96o và vortex.
- Gắn kết lên cột lọc:
+ Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống có màng lọc Dneasy (mini colum). Sau đó ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dưới, giữ lại phần cột có màng lọc.
- Rửa:
+ Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm 8000 vòng trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm. + Thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm 12000 vòng trong 3 phút, bỏ dịch ly tâm.
- Hoà tan:
+ Lấy cột đặt vào ống eppendorf 1,5 ml mới có ghi ký hiệu của mẫu. Thêm 200 µl buffer AE. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm 8000 vòng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống eppendorf.
+ Dịch ly tâm chính là DNA tổng số, bảo quản ở -20oC.
* Tách chiết DNA tổng số từ mẫu phân
- Nhỏ 25 µl dung dịch phân lên tấm giấy FTA® Classic indicating Card, mỗi vòng tròn tấm giấy nhỏ một mẫu phân. Để khô khoảng 1 giờ đồng hồ ở nhiệt độ phòng. Ghi số mẫu lên mỗi tấm giấy.
- Dùng bấm đục lỗ đường kính 1,4 mm, lấy vòng trong giấy vừa đục xong cho vào tube PCR.
- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa FTA Purification Reagent, mỗi lần rửa dùng 200 µl dung dịch FTA và để dung dịch tác động 5 phút sau mỗi lần rửa.
- Rửa 2 lần bằng dung dịch TE 1x, mỗi lần rửa dùng 200 µl dung dịch FTA và để dung dịch tác động trong 5 phút sau mỗi lần rửa. Để khô trong không khí (60 phút) và tiến hành chạy PCR.
2.3.5.2. Quy trình PCR để phát hiện Histomonas meleagridis
* Tiến hành phản ứng PCR - Cách pha mồi:
39
+ Cặp mồi chẩn đoán Histomonas meleagridis dựa theo thiết kế của Karine Huber và cộng sự (2005).
HIS5F: 5’ – CCTTTAGATGCTCTGGGCTG – 3’ HIS5R: 5’ – CAGGGACGTATTCAACGTG – 3’
Với cặp mồi này, DNA được nhân lên với độ dài khoảng 209 bp.
+ Trước khi sử dụng phải pha loãng mồi thành dung dịch có nồng độ 10 µM bằng dung dịch TE 1x và nước cất hai lần.
Pha 600µl dung dịch buffer TE 20x xuống dung dịch buffer TE 1x: (Tức là: Dung dịch TE : H2O = 1 : 19). Vậy để pha 600 µl TE 1x thì hút theo tỷ lệ 30 µl TE 20x và 570 µl H2O, lắc đều thu được dung dịch buffer TE 1x.
Pha 200µl mồi để sử dụng: Hút 180 µl dung dịch TE 1x vừa pha ở trên và thêm vào 20 µl dung dịch mồi đậm đặc.
- Thành phần phản ứng PCR