L ỜI CẢM ƠN
2.5 Quy trình bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng
Chất bảo quản có bổ sung chất chống đông ở tỷ lệ pha loãng cũng như thể tích bảo
quản thông qua các quy trình làm lạnh khác nhau. Tinh trùng sau khi pha loãng được hút
vào dụng cụ bảo quản rồi tiến hành bảo quản trong nitơ lỏng -1960
C. Sau thời gian bảo
quản tiến hành rã đông và đánh giá các thông số hoạt lực tinh trùng.
Phương pháp rã đông: Dùng panh kẹp lấy cọng rạ từ bình nitơ ra và nhúng vào nước ấm ở 37oC trong vòng 30 giây, sau đó dùng kéo cắt 2 đầu cọng rạ cho tinh dịch vào các ống
eppendoft và tiến hành quan sát các thông số hoạt lực dưới kính hiển vi (Olympus BX 41,
Nhật Bản) có kết nối camera (Nikon, Nhật Bản). Tinh trùng sau khi bảo quản được ghi hình lại và dùng phần mềm CASA (computer aide sperm analysis) để đánh giá các thông số hoạt
lực.
Đánh giá các thông số hoạt lực: Các thông số hoạt lực bao gồm: phần trăm hoạt lực
(MOT, %) và vận tốc trung bình (VAP, µm/s) được xác định. Để xác định được các thông
số này, tinh dịch được pha loãng trong nước biển nhân tạo (ASW) (Thành phần của nước
biển nhân tạo có chứa: 27g NaCl, 0,5g KCl, 1,2g CaCl2, 46g MgCl2; 0,5g NaHCO3 trong
1 lít nước cất và có pH 7,8; độ mặn 33‰ và áp suất thẩm thấu là 320 mOsm/kg) với tỷ lệ 1:100. Sau đó, dùng pipet hút 1µl dung dịch trên đặt lên lam kính (Teflon Primted Glass Side: 21 giếng, đường kính mỗi giếng 4mm; Funakoshi Co., Nhật Bản) được phủ lamel lên trên sau đó quan sát liền ở độ phóng đại 400X dưới kính hiển vi (Olympus BX41TF,
Tokyo, Nhật Bản) có kết nối với camera (Nikon D5200, Nhật Bản) camera được thiết lập
28
dưới kính hiển vi. Để xác định hoạt lực và vận tốc, các file được mở bằng phần mềm
ImageJ sử dụng CASA trên website http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html.