L ỜI CẢM ƠN
1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng
1.3.1 Trên thế giới
Trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc luu giữ tinh trùng ở điều kiện nhiệt độ
thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên kể từ khi
công trình của Blaxter được công bố vào năm 1953 trên đối tượng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã được tiến hành phổ biến trên nhiều đối tượng thủy sản. Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh được thực hiện trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [105] với việc sử dụng các dung dịch muối
19
làm chất bảo quản [66] và một số chất làm chất chống đông như DMSO (Dimethyl
sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose. Tóm lại, ở các đối tượng khác
nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau. Và có rất nhiều công trình nghiên cứu
bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi như cá trích [25]; cá hồi [27]; cá mú đen [53]; cá trê châu Âu [74]; cá chình Nhật [89]; cá chép [113, 115];
cá đù vàng [72].
Năm 1986, Chao và ctv [35] công bố kết quả bảo quản tinh 6 loài cá rô phi bao gồm
Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticuscá rô lai giữa O. niloticus và O. mosambicus, và Oreochromis spp. pH của tinh dịch các loài cá rô phi dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và sử dụng chất chống đông là Methanol ở nồng độ 5%. Tinh trùng được pha loãng với tỉ lệ 1:1 và được nhanh chóng làm lạnh xuống - 35oC và hạ nhiệt độ với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng.
Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt được sau 22 ngày bảo quản (tinh rã đông) khá tương đồng với nghiệm thức đối chứng (tinh tươi) (72,7%, và 85,7%); với con lai đạt được tỉ lệ thụ tinh là 93,4%, đối chứng là 90,0%. Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) sau 304 ngày bảo quản, tinh vẫn có khả năng thụ tinh.
Năm 1978, Stein và Bayrle [102] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước
ngọt theo phương pháp của Nagase. Dung dịch bảo quản bao gồm 10% DMSO và hai chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần gồm: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 53 mg Na2HPO4, 23 mg MgSO4.7H2O, 38 mg KCl, 46 mg CaCl2, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2
gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 38 mg KCl, 100 mg glucose, 100 ml nước cất
và 200 ml lòng đỏ trứng gà. Tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo
quản), tinh pha loãng được cho trực tiếp vào nitơ lỏng. Sau 7 ngày bảo quản, tiến hành rã
đông tinh trùng trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1%. Hoạt lực tinh trùng đạt 70% với thời
gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây.
Theo Horváth và Urbanyi (2000) [62], tinh trùng cá trê (Clarias gariepinus) đã được
bảo quản thành công trong nitơ lỏng. Tinh được thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo
20
NaHCO3 0,1N. Tinh sau khi pha loãng với dung dịch theo tỉ lệ 1:1, được cân bằng ở nhiệt độ 3oC trong 10 phút. Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Magyary và ctv [79]. Phương pháp rã đông nhanh
(trong thời gian 5 giây) ở nhiệt độ trong tủ ấm 40oC. Kết quả thụ tinh là 90,0-95,0% so với đối chứng hoạt lực tinh trùng sau khi rã đông là 50,0%.
Kết quả về bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng đã được Horváth và ctv công bố năm 2007. Sử dụng 5 chất bảo quản khác nhau gồm: sucrose, glucose, fructose, KCl và dung dịch muối đẳng trương và 2 chất chống đông được sử dụng: DMSO và Methanol với
nồng độ 10%. Kết quả đạt được cao nhất khi sử dụng glucose và fructose kết hợp với 10%
Methanol là dung dịch bảo quản (tỉ lệ thụ tinh lần lượt là: 74,0±15,0% và 71,0±12,0%) [59].
Năm 2009, Yasui và ctv [121] đã công bố kết quả về ảnh hưởng của phương pháp rã
đông lên hoạt lực của tinh trùng cá trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi bảo quản trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ ở nhiệt độ
35oC trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%.
Tinh trùng của một số loài thuộc họ cá tầm như cá tầm Sterlet (Acipenser ruthenus), cá tầm Beluga (Huso huso) hay cá tầm (Scaphirhynchus albus) đã được nghiên cứu bảo quản trong nitơ lỏng bằng cách pha loãng tinh trùng ở tỉ lệ 1:1, trong đó dung dịch bảo quản gồm
chất bảo quản mT (modified Tsvetkova’s) với thành phần (23,4 mM sucrose; 0,25 mM KCl; 30 mM Tris và pH được điều chỉnh đạt đến 8) và chất chống đông được sử dụng là Methanol 5% và 10%. Tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ nở của tinh trùng sau khi rã đông là cao nhất khi sử dụng 5%
Methanol (39±11% và 32±12%) [63].
Năm 1953, Blaxter là người đầu tiên nghiên cứu bảo quản thành công tinh trùng cá trích (Lupea herenffus) với thời gian bảo quản là sáu tháng ở nhiệt độ - 70oC trong dung dịch nước biển với nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol 12,5%, tinh trùng được
pha loãng ở tỉ lệ 1:4. Kết quả thu được là 80-85,0% trứng thụ tinh với tinh trùng được bảo
21
Cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng ở các đối tượng cá biển, có khoảng 30 loài đã và đang được nghiên cứu [105], nhiều nhất là
ở cá song (Epinephlus taurina). Theo nghiên cứu của Withler và ctv [119] 2 chất bảo
quản được sử dụngở tinh trùng cá song gồm chất bảo quản 1 chứa 7,65 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3 và 251 mg dung dịch đệm hòa trong 1000 ml nước cất và chất bảo quản 2 chứa
6,57 mg NaCl, 4,5 mg NaHCO3 và 251 mg dung dịch đệm hòa trong 1000 ml nước cất.
Chất chống đông là DMSO 10%. Sau khi cân bằng ở 5-10oC tinh được chuyển vào trong các cọng rạ có thể tích 1 ml và lạm lạnh trong hơi nitơ lỏng. Nhiệt độ rã đông ở 21-26oC trong tủ ấm. Kết quả thu được là khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi rã đông.
Dịch tương nhân tạo (ASP-Artificial seminal plasma) và 10% ethylene glycol (EG) là chất bảo quản và chất chống đông tối ưu cho bảo quản tinh trùng cá đù vàng trong nitơ
lỏng. Với quy trình làm lạnh được thực hiện bằng cách hạ nhiệt độ từ nhiệt độ ban đầu
xuống -76oC sau đó cho vào nitơ lỏng ở -196oC, tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 và
được bảo quản trong cọng rạ 0,25ml. Sau đó, các cọng rạ được rã đông ở nước ấm (37oC). Kết quả thu được là tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần và 1 năm rã đông lần lượt là 45,7±3,2%, 27,2±5,0% và 37,5±4,4% 27,2±5,0% [72].
Cùng trên một đối tượng, nhưng ở trong từng điều kiện cụ thể sẽ có một quy trình bảo quản lạnh khác nhau. Ví dụ như cùng trên một đối tượng là cá hồi, Stein và Bayrle [102] đã bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước ngọt theo phương pháp của Nagase. Sau
7 ngày bảo quản, tinh được rã đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1%. Hơn
70,0% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng 30 giây. Trong khi đó, Cabrita và ctv đã tiến hành nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá hồi vân trong cọng rạ có thể tích lớn 0,5 ml, 1,8 ml và 5 ml. Tỷ lệ pha loãng tinh dịch là 1:3 trong
dung dịch theo Erdahl và Graham với 7% DMSO, 10% lòng đỏ trứng và 7,5 mg/ml promine. Kết quả là tỷ lệ thụ tinh ở cọng rạ 0,5 ml là 84,0%, cọng rạ 1,8 ml là 73,2%, cọng rạ 5 ml là 73,0% [27].
1.3.2 Ở Việt Nam
Quy trình bảo quản tinh trùng cũng đã được nghiên cứu ở Việt Nam, song chủ yếu là
22
được lưu giữ ở nhiệt độ thấp khả năng thụ tinh có thể duy trì trong thời gian 1 đến 2 tuần
[14]. Các nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mới được thực hiện từ những năm 2000, nhưng phần lớn cũng chỉ bảo quản trong thời gian ngắn, khoảng một vài ngày.
Một số loài cá nước ngọt như cá chép, trắm cỏ, Mrigan, cá bỗng đã được nghiên cứu
bảo quản tinh thành công, tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng cá chép đạt đến 81,7%, tỷ lệ nở cá
con là 75,0%; cá Trắm cỏ có tỉ lệ thụ tinhtừ 47,3% đến 97,4%, tỷ lệ nở cá con là 77,0%;
cá bỗng có tỷ lệ thụ tinh từ 34,7% đến 51,7%, tỷ lệ nở cá con là 74,0% [3].
Năm 2003, Nguyễn Minh Thành và ctv đã công bố kết quả đề tài nghiên cứu bảo
quản tinh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong nitơ lỏng. Nghiên cứu sử dụng hai chất bảo quản là Hanks và Hanks không canxi, chất chống đông là DMSO 10%, tỷ lệ pha loãng là 1:6 và 1:9. Tinh dịch pha loãng được làm đông trong máy đông
tinh Ncool LM10, sau đó nhúng thẳng vào nitơ lỏng. Các cọng rạ chứa tinh đông được
rã đông sau thời gian bảo quản từ 7 ngày đến 3 tháng trong nitơ lỏng. Các cọng rạ được nhúng trong nước ấm 400C trong 10 giây để rã đông được kiểm tra hoạt lực và thụ tinh với trứng ngay sau khi rã đông. Tỷ lệ thụ tinh trung bình là 30,3% đối với
dung dịch Hanks và 44,5% đối với dung dịch Hanks không canxi [8].
Năm 2012, nghiên cứu của Lê Minh Hoàng và Võ Thị Thu Hiền về bảo quản tinh
trùng cá chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng cho kết quả tốt nhất khi bảo quản trong
chất bảo quản CCSE-2 (Common carp solution extender-2) kết hợp với 10% DMSO là chất chống đông và được bảo quản trong các cọng rạ 0,25ml bằng quy trình làm lạnh 3 bước [7]. Nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis của Nguyễn Thị Thanh Thủy cho kết quả hoạt lực và vận tốc tinh trùng tối ưu (84,89±1,21% và vận tốc đạt 137,22±1,12 μm/s)trong điều kiện: tỷ lệ pha loãng 1:3 trong chất bảo quản ASP cùng với 10% DMSO và sử dụng quy trình làm lạnh 2 bước
(hạ cọng rạ xuống -76oC 5 phút sau đó cho xuống nitơ lỏng) [10].
Tóm lại, quá trình bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng chịu ảnh hưởng của
nhiều yếu tố gồm: tỷ lệ pha loãng, chất bảo quản, chất chống đông, thể tích bảo quản,
quy trình làm lạnh. Một số quá trình bảo quản của các đối tượng cá biển được tóm tắt ở Bảng 1.4
23
Bảng 1.4 Kết quả bảo quản lạnh tinh trùng một sốđối tượng cá biển trong nitơ lỏng
Tên cá Phương pháp Phương pháp bảo quản Tỷ lệ pha loãng dung dịch Thời gian bảo quản Kết quả sau bảo quản (%) Tài liệu tham khảo Chất bảo quản Chất chống đông (tỷ lệ)
Cá bơn nâu Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ
lỏng SS
DMSO
(10) 1:5 14 tuần 66
TLTT [32]
Cá bơn vân Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ
lỏng SS EG (5) 1:5 10 ngày 68
TLS [32]
Cá bơn olive Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ
lỏng SS EG (10) 1:5 2 ngày 67 TLTT [32] Cá efin (haddock), Melanogrammus aeglefinus Làm lạnh tự động có đặt sẵn chương trình làm lạnh cọng rạ MME DMSO (10) 1:3 5 ngày 53 TLTT [42] Cá kình đỏ Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng Glucose 10% Glycerol (12.5) 1:4 740 ngày 31 TLN [67] Cá bơn sao, Platichthys stellatus Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng ASP DMSO (10) 1:3 1 năm >18 HL [75] Cá thờn bơn, Verasper variegatus Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng TS-2 DMSO (13.3) 1:2 24h 35 TLTT [110] Cá đù vàng, Larimichthys polycatis Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng ASP EG (10) 1:3 1 năm 38 TLTT [72] Cá tráp đỏ, Pagrus major Làm lạnh tự động có đặt sẵn chương trình làm lạnh cryovials Cortland DMSO (15) 1:3 1 tuần 93,8 TLTT [78]
24 Paralichthys orbignyanus lỏng sucrose và chất pha loãng (10) 67TLN Cá tráp, Sparus aurata Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng NaCl 1% DMSO (10) 1:6 48h [44] Cá mú răng dài, Epinephelus bruneus Glucose (0.3) Glycerol (10) 1:2 [76] Cá tráp, Sparus aurata Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng NaCl 1% DMSO (10) 1:9 2 năm 3 năm 100TLTT 75TLTT [30] Cá chẽm mõm nhọn, Psammoperca waigiensis Làm lạnh cọng rạ bằng hơi nitơ lỏng ASP DMSO (10) 1:3 1 tuần 1 tháng 1 năm 67TLTT, 44TLN 65TLTT, 44TLN 65TLTT, 43TLN [10]
Kết quả sau bảo quản: TLTT: Tỷ lệ thụ tinh, HL: Hoạt lực, TLN: Tỷ lệ nở
Chất chống đông: DMSO: dimethyl sulfoxide, EG: ethylene glycol
Chất bảo quản: ASP: artificial semina plasma, MME: modified Mounib’s extender, MFRS: marine fish Ringer’s
25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu
2.2.1 Địa điểm
Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm NORAD - Viện Nuôi Trồng Thủy Sản – trường Đại học Nha Trang.
2.1.2 Thời gian nghiên cứu
Từ 9/12/2015 đến 9/6/2016
2.1.3 Đối tượng nghiên cứu
Tinh trùng cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus (Forsskal, 1775)
2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mú cọp trong nitơ lỏng. 2.3 Chọn cá đực và thu tinh
2.3.1 Chọn cá đực
Chọn cá đực thành thục tốt, màu sắc tươi sáng, hoạt động tốt không bị bệnh hoặc
xây xát, dị tật. Vuốt nhẹ bụng cá thấy tinh dịch màu trắng sữa chảy ra. Tinh dịch cá mú cọp
Chất bảo quản (CBQ) tốt cho bảo quản lạnh
Chất chống đông
CBQ Tỷ lệ pha loãng Thể tích bảo quản
5 chất chống đông khác nhau 9 CBQ khác nhau 1:1, 1:3, 1:6, 1:9 3 thể tích bảo quản khác nhau
Đánh giá các điều kiện tối ưu cho bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng
Quy trình bảo quản 3 quy trình bảo quản khác nhau
26
2.3.2 Vuốt và thu tinh
Việc thu tinh được tiến hành vào sáng sớm lúc trời mát. Cá được bắt nhẹ nhàng bằng
vợt và được lau khô vùng lỗ sinh dục bằng khăn mềm. Sau đó tinh dịch được thu vào ống
eppendorf (1,5 ml) bằng cách vuốt nhẹ 2 bên bụng cá từ trên xuống. Tinh dịch được thu
không có lẫn phân, nước tiểu, máu và nước. Ống eppendorf được đặt trên đá bào để giữ
lạnh đến khi tiến hành thí nghiệm.
2.4 Đánh giá mật độ và hoạt lực tinh trùng trước khi thí nghiệm 2.4.1 Xác định mật độ 2.4.1 Xác định mật độ
Mật độ tinh trùng được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Haematocymetes
(MARIENFIELD, Germany) trên kính hiển vi có độ phóng đại 400X. Tinh dịch được pha
loãng trong ống nghiệm với tỷ lệ pha loãng là 1:1000, lắc đều sau đó hút tinh dịch đã pha loãng cho một ít lên buồng đếm hồng cầu đã chuẩn bị sẵn. Đếm tinh trùng trong các ô
đếm hồng cầu (đếm tổng số tinh trùng trong 4 ô đếm ở 4 góc và 1 ô ở giữa). Mật độ tinh trùng được xác định theo công thức:
M = A x 4000 x R x 1000 80
Trong đó: M: Mật độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch (TB/ml)
A: Tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm
R: Độ pha loãng
1000: Hệ số pha loãng
80: Tổng số ô đếm
4000: Số nghịch đảo thể tích dung dịch của 1 ô
2.4.2 Xác định hoạt lực của tinh trùng
Tinh trùng được pha loãng trong nước cất với tỷ lệ 1:100, sau đó hút 1 μl dung dịch
chứa tinh đã được pha loãng cho lên lamel và quan sát sự vận động của tinh trùng dưới
kính hiển vi ở độ phóng đại 400X những mẫu có tinh trùng hoạt lực trên 90% được đưa
27 Bảng 2.1 Một sốđặc điểm lý học của tinh dịch cá mú cọp Thông số Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Thể tích tinh dịch (ml/cá đực) 1,10 1,50 1,28±0,15 Mật độ tinh trùng (x 109 TB/ml) 28,70 34,40 31,35±2,12 Hoạt lực tinh trùng (%) 94,00 98,00 95,80±1,23
Qua Bảng 2.1 cho thấy tinh trùng đưa vào nghiên cứu có chất lượng tương đối cao
và phù hợp cho nghiên cứu.
2.5 Quy trình bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng
Chất bảo quản có bổ sung chất chống đông ở tỷ lệ pha loãng cũng như thể tích bảo
quản thông qua các quy trình làm lạnh khác nhau. Tinh trùng sau khi pha loãng được hút
vào dụng cụ bảo quản rồi tiến hành bảo quản trong nitơ lỏng -1960
C. Sau thời gian bảo
quản tiến hành rã đông và đánh giá các thông số hoạt lực tinh trùng.