L ỜI CẢM ƠN
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng
1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mẫu
Đây là khâu đầu tiên rất quan trọng vì chất lượng tinh trùng của cá đực có tốt hay không phụ thuộc vào mức độ thành thục và điều kiện sống của cá đực. Khả năng vận động của tinh trùng chưa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với tinh trùng
thành thục vừa. Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh
trùng.
1.2.5.2 Tỷ lệ pha loãng
Theo Stein và Bayrle [102] tỷ lệ thích hợp cho cá chép là 1:3; Legendre và Billard [73] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá hồi là 1:3; đây cũng là tỷ lệ pha loãng tối ưu cho nhiều đối tượng như: cá đù vàng [72], cá chẽm mõm nhọn [10], cá tuyết Đại Tây Dương [86]; Harvey [58] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá rô phi là 1:5. Đối với tinh trùng cá đù Đại Tây Dương, cá mú sẫm thì 1:9 là tỷ lệ pha loãng thích hợp nhất cho
tỷ lệ thụ tinh là 57% [86]. Ở tỷ lệ pha loãng 1:1, tinh trùng một số đối tượng cho kết quả
sau bảo quản tốt nhất như: cá điêu hồng [36], cá nheo Mỹ [111], cá mút [112]. Ngoài ra, tinh trùng cá tráp Sparus aurata sau khi bảo quản lạnh cho kết quả tốt nhất ở tỷ lệ 1:6
[44].
Việc lựa chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp sẽ nâng cao sức sống của tinh trùng khi rã đông, vì vậy nghiên cứu để đưa ra các tỷ lệ thích hợp cho từng loài là cần thiết [91].
1.2.5.3 Chất bảo quản
Chất bảo quản là một dung dịch muối, có tác dụng làm tăng dung tích và duy trì trạng thái vô hoạt cũng như thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng. Việc nghiên cứu tìm ra chất bảo quản thích hợp không những có thể đạt được mục đích pha loãng tăng dung tích của tinh dịch mà còn có thể nâng cao tỉ lệ thụ tinh của tinh dịch, kéo dài thời gian
sống cũng như tiết kiệm được nhiều tinh dịch. Lựa chọn chất bảo quản cần chú ý các điều
kiện sau:
14 - Tránh được sự kích thích của nhiệt độ.
- Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dich hoặc nguyên sinh chất
trong tinh trùng.
- Có pH thích hợp với pH tinh dịch.
- Giúp tinh trùng sống nhưng không vận động.
Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ được tinh trùng ở
trạng thái bất động. Chất bảo quản có thể được pha chế trước và giữ trong tủ lạnh trước
khi sử dụng. Tỷ lệ pha loãng tối ưu cần được xác định theo từng loài [116].
Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp. Một vài dung dịch đơn
giản như dung dịch chứa NaCl, NaHCO3 và Leceithin [82] cũng cho hiệu quả tốt. Ở một
số loài cá biển như cá trích Clupea harengus và cá đối Mugil cephalus [25]; các tác giả đã sử dụng thành công nước biển pha loãng cho thêm chất chống đông. Những nghiên cứu
gần đây trên cá rô phi cho thấy sử dụng nước pha thêm 5% Methanol và 15% sữa bột để
pha loãng sẹ cũng có kết quả [82].
Gần đây một số tác giả đã sử dụng đường để làm chất bảo quản cho một số loài cá nước ngọt. Horváth và ctv [61] đã sử dụng chất bảo quản với thành phần là 350mM glucose, 30mM Tris, pH 8,0 và 10% Methanol cho cá chép. Yavas và Bozkurt [122] sử
dụng 350mM glucose, 30mM Tris, và 5% Glycerol (pH = 8,0) cho cá trắm cỏ và kết quả
tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau bảo quản là 85,6±2,8%, hoạt lực tinh trùng sau bảo quản
là 83,4±2,1%. Tóm lại, việc lựa chọn và sử dụng chất bảo quản là một khâu quan trọng
góp phần vào sự thành công của kỹ thuật bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.
Tinh trùng cá mú nghệ Epinephelus lanceolatus cho hoạt lực và vận tốc tinh trùng sau rã đông là tốt nhất khi sử dụng chất bảo quản MPRS và TS-19 [45]; tinh trùng cá mú
răng dài Epinephelus bruneus thì chất bảo quản thích hợp lại là Glucose 0,3M [76]; tinh trùng cá mú sọc Epinephelus septemfasciatus bảo quản trong ES1-3 cho kết quả tốt hơn
15
Bảng 1.1 Các chất bảo quản dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng một vài loài cá Loài Loại chất bảo quản Tài liệu tham khảo
Cá bơn Dung dịch Stein [31]
Cá bơn chấm
Verasper variegatus Dung dịch Turbot [110]
Cá đù vàng
Larimichthys polyactis Dịch tương nhân tạo [72]
Cá chình Nhật Bản
Anguilla japonica Dung dịch Suquet [107]
Cá vược Nhật
Lateolabrax japonicus MPRS [37]
Cá tuyết Đại Tây Dương
Gadus morhua, cá tuyết chấm đen
Melanogrammus aeglefinus
Sửa đổi của Mounib [96]
Cá tráp Sparus aurata, cá mú Epinephelus
malabaricus
150mM NaCl [54, 55]
1.2.5.4 Chất chống đông và nồng độ chất chống đông
Chất chống đông (chất bảo vệ tế bào) là những hợp chất nhỏ có khả năng xâm nhập
vào các tế bào tinh trùng. Chất chống đông được thêm vào chất bảo quản để hạn chế tối đa ảnh hưởng của sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống lâu trong quá trình làm lạnh và rã đông.
Một số nghiên cứu cho thấy, ở nhiệt độ thấp, khi trong dung dịch bảo quản không có chất
chống đông, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tượng bị kết lại và tế bào bị phá hủy,
dẫn đến tinh trùng bị chết. Hiện nay, các chất chống đông thường được sử dụng nhất là DMSO, Glycerol và Methanol. Một việc quan trọng nữa là nồng độ chất chống đông.
Nồng độ chất chống đông phải thích hợp thì mới bảo vệ được các tế bào tốt nhất trong
quá trình làm lạnh và rã đông. Nồng độ các chất chống đông của các loài cá khác nhau thì khác nhau, và nồng độ tốt nhất cho các loài cá thường từ 10-15% bao gồm cả DMSO,
Glycerol và Methanol.
Bảng 1.2 Các loại chất chống đông dùng trong nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng [34] Acetamide Aline (L) Albumin Ammonium Formamide Glucose Glycerol Glycerophosphate Methanol Methyl acetamide Methyl formamide Methyl urea Sodium chloride Sodium iodide Sodium nitrate Sodium sulfate
16 acetate Chloroform Choline Dexatrans Diethyle glycol Dimethyl acetamide Dimethyl formamide Dimethyl sulfoxide Erythritol Ethanol Ethylene glycol Glycerol monoacetate Glycerin Hydroxyethyl starch Inositol Lactose Magnesium chloride Magnesium sulfate Maltose Mannitol Mannose Phenol Pluronic polyols Polyethylene glycol Polyvinyl pyrrolidone Proline Propylene gycol Pyridine-N-Oxide Ribose Serine Sodium bromide Sorbitol Sucrose Triethylene glycol Trimethylamine acetate Urea Valine Xylose
Nghiên cứu bảo quản tinh cá rô phi vằn O. niloticus của Rana và McAndrew [94] cho thấy DMSO có độc tố nặng hơn Methanol khi so sánh các mức nồng độ giống nhau.
Có loài có phổ DMSO khá rộng như cá đù đỏ (Sciaenop ocellatusa) 7-15%, nhưng cá hồi
(Salmonid sp) chỉ cho kết quả tốt khi sử dụng Methanol 10%. Tóm lại, việc lựa chọn chất
chống đông và nồng độ các chất chống đông là một trong những yếu tố góp phần vào thành công của bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng.
Nghiên cứu này sử dụng DMSO, DMA, Methanol, Glycerol, Ethylene glycol làm chất
chống đông cho quá trình bảo quản lạnh tinh trùng trong nitơ lỏng vì theo một nghiên cứu trước đây cho thấy những chất này thích hợp cho quá trình bảo quản lạnh tinh trùng trong
nitơ lỏng. Hơn thế nữa, những chất này được tìm mua dễ dàng trên thị trường và khá phổ
biến.
Bảng1.3 Các loại chất chống đông dùng cho bảo quản lạnh tinh trùng của một vài loài cá
Loại chất chống đông Kết hợp với Loài cá Tài liệu tham khảo
Glucose 5% Ringer Cá măng, Chanos
chanos [87] Mật ong 0,5% Ringer Cá mùi đen, Acanthopagrus schlegeli [87]
Sữa Ringer-methanol Cá rô phi,
17
niloticus
Lòng đỏ trứng 10% DMSO Cá rô vàng, Perca
flavescens [40] Lòng đỏ trứng 20% + sucrose 0,5% - Cá hồi vân, Ochorhynchus mykiss [68]
Lòng đỏ trứng 15% DMSO Cá trê, Mytus
nemurus [123]
Lòng đỏ trứng 10% + sucrose 0,6M Erdahl-DMSO Cá chó, Esox
lucius [22]
1.2.5.5 Quy trình làm lạnh
Một trong những yếu tố quan trọng trong kỹ thuật bảo quản lạnh là tốc độ hạ nhiệt.
Tốc độ hạ nhiệt phải đủ chậm để cho nước ra khỏi các tế bào để các tinh thể băng không
hình thành trong các tế bào và nhanh chóng gia tăng nồng độ muối trong các tế bào để
không làm hỏng các thành phần trong tế bào [80, 81]. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng lớn đến
thành công của việc bảo quản tinh, vì vậy cần tìm được chu trình hạ nhiệt phù hợp cho
từng đối tượng nghiên cứu. Có nhiều phương pháp làm lạnh hỗn hợp tinh dịch trước khi
chuyển vào lưu giữ trong nitơ lỏng. Có thể làm lạnh trong nitơ lỏng cách bề mặt của nó
khoảng 3-10 cm, hoặc làm lạnh trong đá. Thuận lợi hơn cả là làm lạnh bằng chương trình hạ nhiệt được cài sẵn trong máy tính. Tốc độ làm lạnh được điều chỉnh với các tốc độ
khác nhau tùy theo loài. Trong thực tế, phương pháp làm lạnh thành công và thực tế nhất
về bảo quản lạnh tinh trùng cá là phương pháp làm lạnh hai bước. Bước đầu tiên là giảm
nhiệt độ của tinh trùng từ nhiệt độ lưu giữ (ví dụ, nhiệt độ lưu giữ bình thường tinh trùng cá hồi là 4oC) đến khoảng -70oC. Tốc độ làm lạnh tối ưu cho tinh trùng từng loài khác nhau ở bước này là khác nhau. Bước thứ hai là cho tinh dịch vào nitơ lỏng -196oC [38].
Theo Forgason và ctv [48] phương pháp làm lạnh trong hơi nitơ lỏng ở mức cao vào khoảng 5-10cm trong khoảng thời gian từ 10-12 phút sau đó chuyển từ từ xuống nitơ
lỏng, phương pháp này không cần thời gian cân bằng. Moczarski [83] cũng làm lạnh tinh
cá chép Nhật Bản trên bề mặt và cách nitơ lỏng 3-5cm. Phương pháp của Bouysson và Chupin [11] đã thử nghiệm trên các mức nhiệt độ khác nhau trong nitơ lỏng như: nhiệt độ
18
là -50oC xuống -55oC. Dung dịch tinh cá hồi có chứa 7-10% DMSO làm lạnh với tốc độ
hạ nhiệt 30-35oC/phút bằng chương tình đã cài đặt sẵn trong máy tính, kết quả từ 0-98% trứng được thụ tinh. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần
tìm ra quy trình hạ nhiệt phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu.
1.2.5.6 Phương pháp rã đông
Sau quá trình bảo quản, tinh cá cần phải được rã đông để đưa vào sử dụng. Do điều
kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng thái kết tinh nên cần áp dụng phương pháp rã đông chính xác mới đảm bảo tinh trùng sống lại sau khi rã đông. Tùy vào các loài cá khác nhau, việc sử dụng các chất chống đông và điều kiện thí nghiệm mà tiến
hành rã đông ở các thang nhiệt độ và thời gian rã đông khác nhau. Ví dụ Horvath và Urbanyri [59] rã đông tinh trùng cá trê ở 40oC trong 5 giây, tỷ lệ vận động của tinh trùng
đạt 50%. Yasui và ctv [121] rã đông tinh trùng cá chạch Misgurnus anguillicaudatus ở
nhiệt độ 25oC trong 10 giây cho kết quả thụ tinh là 47%. Theo nghiên cứu của Le và ctv
[72] đã tiến hành rã đông tinh trùng cá đù vàng Larimichthys polyactis ở nhiệt độ 37oC trong 30 giây, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở sau 1 tuần lần lượt là 45,7±3,2% và 27,2±5,0%.
Dựa vào những đặc điểm và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng, cho
đến nay đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng
nguyên tinh dịch trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp đã có thể kéo dài tuổi thọ của
tinh trùng một cách hiệu quả. Đặc biệt là phương pháp bảo quản tinhtrùng trong nitơ lỏng đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới.
1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng 1.3.1 Trên thế giới 1.3.1 Trên thế giới
Trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc luu giữ tinh trùng ở điều kiện nhiệt độ
thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên kể từ khi
công trình của Blaxter được công bố vào năm 1953 trên đối tượng cá trích (Clupea herengus), việc bảo quản tinh đã được tiến hành phổ biến trên nhiều đối tượng thủy sản. Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh được thực hiện trên hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [105] với việc sử dụng các dung dịch muối
19
làm chất bảo quản [66] và một số chất làm chất chống đông như DMSO (Dimethyl
sulfoxide), Ethylene glycol, Methanol, Glycerol, Trehalose. Tóm lại, ở các đối tượng khác
nhau sẽ có các quy trình bảo quản tinh khác nhau. Và có rất nhiều công trình nghiên cứu
bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và công bố rộng rãi như cá trích [25]; cá hồi [27]; cá mú đen [53]; cá trê châu Âu [74]; cá chình Nhật [89]; cá chép [113, 115];
cá đù vàng [72].
Năm 1986, Chao và ctv [35] công bố kết quả bảo quản tinh 6 loài cá rô phi bao gồm
Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticuscá rô lai giữa O. niloticus và O. mosambicus, và Oreochromis spp. pH của tinh dịch các loài cá rô phi dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản bao gồm 15% sữa và sử dụng chất chống đông là Methanol ở nồng độ 5%. Tinh trùng được pha loãng với tỉ lệ 1:1 và được nhanh chóng làm lạnh xuống - 35oC và hạ nhiệt độ với tốc độ 5oC/ phút cho tới -70oC rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng.
Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng rã đông đạt được sau 22 ngày bảo quản (tinh rã đông) khá tương đồng với nghiệm thức đối chứng (tinh tươi) (72,7%, và 85,7%); với con lai đạt được tỉ lệ thụ tinh là 93,4%, đối chứng là 90,0%. Riêng cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) sau 304 ngày bảo quản, tinh vẫn có khả năng thụ tinh.
Năm 1978, Stein và Bayrle [102] tiến hành bảo quản tinh trùng các loài cá hồi nước
ngọt theo phương pháp của Nagase. Dung dịch bảo quản bao gồm 10% DMSO và hai chất bảo quản khác nhau; chất bảo quản 1 có các thành phần gồm: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 53 mg Na2HPO4, 23 mg MgSO4.7H2O, 38 mg KCl, 46 mg CaCl2, 100 mg glucose, 500 mg glycine, 100 ml nước cất và 200 ml lòng đỏ trứng gà; chất bảo quản 2
gồm có: 750 mg NaCl, 200 mg NaHCO3, 38 mg KCl, 100 mg glucose, 100 ml nước cất
và 200 ml lòng đỏ trứng gà. Tinh trùng được pha loãng ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch: chất bảo
quản), tinh pha loãng được cho trực tiếp vào nitơ lỏng. Sau 7 ngày bảo quản, tiến hành rã
đông tinh trùng trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1%. Hoạt lực tinh trùng đạt 70% với thời
gian hoạt động của tinh trùng chỉ trong 30 giây.
Theo Horváth và Urbanyi (2000) [62], tinh trùng cá trê (Clarias gariepinus) đã được
bảo quản thành công trong nitơ lỏng. Tinh được thu bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo
20
NaHCO3 0,1N. Tinh sau khi pha loãng với dung dịch theo tỉ lệ 1:1, được cân bằng ở nhiệt độ 3oC trong 10 phút. Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ thể tích 0,25 ml và làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Magyary và ctv [79]. Phương pháp rã đông nhanh
(trong thời gian 5 giây) ở nhiệt độ trong tủ ấm 40oC. Kết quả thụ tinh là 90,0-95,0% so với đối chứng hoạt lực tinh trùng sau khi rã đông là 50,0%.
Kết quả về bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng đã được Horváth và ctv công bố năm 2007. Sử dụng 5 chất bảo quản khác nhau gồm: sucrose, glucose, fructose, KCl và dung dịch muối đẳng trương và 2 chất chống đông được sử dụng: DMSO và Methanol với
nồng độ 10%. Kết quả đạt được cao nhất khi sử dụng glucose và fructose kết hợp với 10%
Methanol là dung dịch bảo quản (tỉ lệ thụ tinh lần lượt là: 74,0±15,0% và 71,0±12,0%) [59].
Năm 2009, Yasui và ctv [121] đã công bố kết quả về ảnh hưởng của phương pháp rã
đông lên hoạt lực của tinh trùng cá trắm cỏ Ctenophayryngodon idella sau khi bảo quản trong nitơ lỏng bằng các cách rã đông khác nhau, kết quả là rã đông các cọng rạ ở nhiệt độ
35oC trong 30 giây cho phần trăm hoạt lực cao nhất 83,4±2,1%.
Tinh trùng của một số loài thuộc họ cá tầm như cá tầm Sterlet (Acipenser ruthenus), cá tầm Beluga (Huso huso) hay cá tầm (Scaphirhynchus albus) đã được nghiên cứu bảo quản