Kiểm tra kháng thể kháng virus Gumboro bằng phương pháp ELISA sau khi tiêm phòng vaccine.
Khảo sát tác động của việc lấy máu kiểm tra có gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tăng trọng của gà.
3.2 Phƣơng tiện thí nghiệm
3.2.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 07/2013 đến tháng 11/2013.
Địa điểm thí nghiệm: gà thí nghiệm được nuôi tại trại thực nghiệm Ba Hoàng, phường Thới An Đông, Quận Bình Thủy, Thành Phố Cần Thơ.
Xét nghiệm kiểm tra huyết thanh, định lượng kháng thể chống virus Gumboro bằng phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể, xét nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh truyền nhiễm Bộ Môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ.
3.2.2 Đối tượng thí nghiệm
Gà nuôi thí nghiệm là giống gà Tàu Vàng, gà được nuôi lúc 1 ngày tuổi, có trọng lượng tương đối đồng đều nhau, số lượng trống mái ở mỗi lô theo quá trình ngẫu nhiên của giống. Tổng số gà thí nghiệm là 63 con.
3.2.3 Vật liệu thí nghiệm
Vật liệu và dụng cụ
Ống tiêm y tế 1ml, 3ml, 5ml, bông gòn, găng tay, khẩu trang, cân, sổ ghi chép, viết, ống nghiệm vô trùng, giá đựng ống nghiệm, thùng trữ mẫu, máy ly tâm, máy lắc mẫu, eppendorf, micropipete, kéo, parafilm.
Mẫu vật và sinh phẩm
Huyết thanh gà.
Vaccine phòng bệnh đậu gà, vaccine phòng bệnh cúm gia cầm, vaccine phòng bệnh Newcastle, vaccine tụ huyết trùng gia cầm, vaccine nhược độc phòng bệnh Gumboro (nguồn: Navetco).
Dung dịch sinh lý 0,85%, nước cất, ELISA kit (USA) do công ty Thịnh Á phân phối.
Thành phần bộ kit:
STT Thành phần Số lƣợng
1 Đĩa 96 giếng được hấp phụ kháng nguyên 5
2 Đối chứng dương 1,9 ml
3 Đối chứng âm 1,9 ml
4 Dung dịch Conjugate 50 ml
5 Dung dịch pha loãng mẫu 253 ml
6 Dung dịch TMB 60 ml
7 Dung dịch Stop 60 ml
3.3 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm
3.3.1 Qui trình chăm sóc gà thí nghiệm
Chuồng trại
Tiến hành vệ sinh sát trùng chuồng úm, lồng úm, máng ăn, máng uống từ 5- 7 ngày trước khi nuôi. Gà từ 1 ngày tuổi đến 4 tuần tuổi được nuôi úm trên lồng, mỗi lồng úm sử dụng một bóng đèn tròn có công suất 65W. Xung quanh chuồng được che kín cẩn thận để tránh mưa tạt, gió lùa, phía dưới nền chuồng có lớp trấu trộn men vi sinh với độ dày khoảng 20cm.
Từ tuần thứ 5 gà không còn nuôi úm, chuyển gà xuống nuôi nền xung quanh rào bằng lưới B40, sử dụng trấu làm chất độn chuồng có trộn thêm men vi sinh để hạn chế mùi với độ dày 25-30cm, cho gà ăn uống bình thường, vệ sinh tốt chuồng trại.
Mật độ nuôi
1 ngày đến 2 tuần tuổi: 50 con/m2 2 tuần đến 3 tuần tuổi: 35 con/m2 3 tuần đến 4 tuần tuổi: 30 con/m2 4 tuần đến 5 tuần tuổi: 25 con/m2 5 tuần đến 6 tuần tuổi: 20 con/m2 6 tuần đến 7 tuần tuổi: 15 con/m2 7 tuần đến xuất chuồng: 10 con/m2
Thức ăn và nƣớc uống
Gà được cho ăn uống tự do, cung cấp nước sạch, mát cho gà uống. Sử dụng thức ăn hỗn hợp dạng viên C225 và C235 của công ty Proconco (Pháp) cho gà ăn, bổ sung thêm Bcomplex, vitamin C.
Hỗn hợp C225 viên cho gà ta, gà tàu từ 1-42 ngày tuổi
Nguyên liệu chính: bắp, tấm, cám gạo, cám mì, khoai mì, bánh dầu đậu nành, bánh dầu cải, đạm động vật và thực vật, vitamin, khoáng, phụ gia.
Thành phần dinh dưỡng:
Năng lượng trao đổi (min) 2850Kcal/kg
Protein thô (đạm) (min) 20%
Xơ thô (max) 7%
Canxi (min-max) 0,7-1,6%
Phospho tổng số (min-max) 0,5-1,1%
Lysine tổng số (min) 1,0%
Methionine + Cystine (min) 0,8%
Colistine (max) 80mg/kg
Độ ẩm (max) 13%
Hỗn hợp C235 viên cho gà ta, gà tàu trên 42 ngày tuổi
Nguyên liệu chính: chất bột đường, đạm động vật và thực vật, vitamin, khoáng vi-đa lượng, phụ gia.
Thành phần dinh dưỡng:
Năng lượng trao đổi (min) 2900Kcal/kg
Protein thô (đạm) (min) 16,5%
Xơ thô (max) 6%
Canxi (min-max) 0,7-1,5%
Phospho tổng số (min) 0,45%
Nacl (min- max) 0,2-0,5%
Trong quá trình nuôi dưỡng gà thí nghiệm, đàn gà được tiêm phòng đầy đủ các bệnh theo qui trình (bảng 3.1).
Bảng 3.1: Qui trình phòng bệnh chung
3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Gà thí nghiệm được nuôi lúc 1 ngày tuổi, thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 7 con/ nghiệm thức, gồm 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Lặp lại Nghiệm thức
Số gà trong thí nghiệm (con)
NT1 NT2 NT3
I 7 7 7
II 7 7 7
III 7 7 7
NT1: sử dụng vaccine Gumboro; NT2: đối chứng-vaccine; NT3: đối chứng-tăng trọng
Nghiệm thức 1 (NT1) và nghiệm thức 3 (NT3): gà được tiêm vaccine đầy đủ theo qui trình, riêng ở NT1 gà được lấy máu định kỳ để theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch, NT3 không lấy máu nhằm khảo sát sự sinh trưởng và tăng trọng của gà.
Nghiệm thức 2 (NT2): nghiệm thức đối chứng không tiêm phòng vaccine Gumboro, lấy máu định kỳ kiểm tra kháng thể thụ động.
Ngày tuổi Tên vaccine Tên công ty Cách tiêm ngừa
3 7 10 15 18 21 30 40 Lasota Gumboro Đậu Cúm Lasota Gumboro Cúm Tụ huyết trùng Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Navetco Nhỏ mắt mũi Nhỏ mắt mũi Chủng qua cánh Tiêm dưới da cổ Nhỏ mắt mũi Nhỏ mắt mũi Tiêm dưới da cổ Tiêm dưới da cổ
3.4 Các phƣơng pháp thực hiện xét nghiệm Phƣơng pháp lấy máu
Lấy máu tim lúc gà được 3, 10, ngày tuổi tiếp tục lấy máu ở tĩnh mạch cánh lúc 17, 24, 35, 49và trước khi xuất bán để kiểm tra kháng thể thụ động.
Lấy máu ở tĩnh mạch cánh đối với nghiệm thức gà sau khi sử dụng vaccine 35, 49 và lúc trước khi xuất bán để kiểm tra đáp ứng miễn dịch sau tiêm vaccine.
Mỗi con lấy khoảng 0,5-2 ml máu (tuỳ vào giai đoạn tuổi của gà), cho vào ống nghiệm vô trùng, lưu ý không sử dụng chất kháng đông, ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho máu đông, đến khi có huyết thanh đem ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút, chiết lấy huyết thanh cho vào ống eppendorf bảo quản ở - 200C cho đến khi xét nghiệm.
Qui trình xét nghiệm kiểm tra kháng thể kháng virus Gumboro bằng phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Nguyên lý: kỹ thuật ELISA là phản ứng huyết thanh học dựa vào phản ứng miễn dịch học giữa kháng nguyên và kháng thể chuẩn. Kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu huyết thanh dương tính sẽ được gắn kết với kháng thể hoặc kháng nguyên đã được gắn sẵn trong giếng. Thành phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi, phần giữ lại tiếp tục kết hợp với Conjugate (chất kết hợp) có enzyme peroxidase. Phản ứng chuyển màu (từ không màu thành màu xanh dương) khi có sự tham gia của cơ chất Chromagen. Mức độ màu thể hiện ở mỗi giếng tương ứng với hàm lượng kháng thể ở mỗi mẫu xét nghiệm. Máy đọc ở bước sóng phù hợp sẽ xác định lượng kháng thể hoặc kháng nguyên bị giữ lại trong giếng.
Phƣơng pháp thực hiện
Chuẩn bị mẫu:
Cho 500l dung dịch pha mẫu vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng (đĩa sạch). Đĩa này được gọi là đĩa pha loãng huyết thanh, dùng máy lắc trộn đều mẫu huyết thanh và dung dịch pha mẫu.
Sau đó cho 1l huyết thanh cần kiểm tra vào mỗi giếng (pha loãng theo tỷ lệ 1:500). Bắt đầu với giếng A5 và kết thúc bằng giếng H12 (di chuyển trái sang phải) như hình 3.1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + - - 1 2 3 4 5 6 7 8 B 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 D 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 E 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 F 57 57 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 G 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 H 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí huyết thanh cho xét nghiệm ELISA
Qui trình thực hiện phản ứng
1. Ghi lại vị trí của mẫu bố trí trên đĩa.
2. Cho 100 l đối chứng dương không bị pha loãng vào giếng A1 và A2. 3. Cho 100 l đối chứng âm không bị pha loãng vào giếng A3 và A4. 4. Cho 100 l mẫu pha loãng, vào đúng vị trí các giếng còn lại. 5. Ủ đĩa trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
6. Giũ hết chất lỏng trong các giếng vào bồn rửa dụng cụ.
7. Cho 350l nước cất vào mỗi giếng, sau đó loại bỏ các chất lỏng. Lập lại việc rửa 3-5 lần.
8. Cho 100l dung dịch Conjugate vào mỗi giếng thí nghiệm. 9. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
10. Lặp lại bước 6 và 7 ở trên.
11. Cho 100l dung dịch TMB vào mỗi giếng. 12. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
13. Cho 100l dung dịch Stop vào mỗi giếng.
Tính toán kết quả
Trung bình đối chứng dương tính (PCX) = OD Giếng A1+ OD Giếng A2 2
Trung bình đối chứng âm tính (NCX) = OD Giếng A3+ OD Giếng A4 2
Tỷ số S/P = OD mẫu - (NCX) (PCX) - (NCX)
Hiệu giá kháng thể (X): Log10 X = 1,09 (log10 S/P) + 3,36 X = 10 ^ [1,09 (log10 S/P + 3,36)]
Kết quả
Kết quả IBD ELISA có giá trị khi mật độ quang trung bình (OD) của đối chứng huyết thanh âm tính là nhỏ hơn 0,150 và trung bình đối chứng dương tính lớn hơn 0,750. Nếu một trong những giá trị này vượt ra khỏi phạm vi trên, kết quả xét nghiệm IBD nên được coi là không hợp lý và mẫu phải được kiểm tra lại. Tỷ số S/P trong phạm vi nhỏ hơn hoặc bằng 0,2 (hiệu giá kháng thể bằng hoặc nhỏ hơn 396), cho kiểm tra huyết thanh âm tính và lớn hơn 0,2 (hiệu giá kháng thể lớn hơn 396) cho kiểm tra huyết thanh dương tính.
3.5 Phƣơng pháp theo dõi tốc độ tăng trƣởng và tiêu tốn thức ăn
Phương pháp này được tiến hành trên 2 nghiệm thức đều có sử dụng vaccine Gumboro (NT1 và NT3) nhưng điểm khác nhau ở 2 nghiệm thức là: NT1 có tiến hành định kỳ lấy máu kiểm tra kháng thể, ở NT3 không có lấy máu. Để tiến hành phương pháp này cần sự theo dõi và ghi chép cẩn thận.
Theo dõi tốc độ tăng trưởng của gà, tiến hành cân trọng lượng của gà lúc 1 ngày tuổi, kết thúc giai đoạn úm (28 ngày tuổi) và lần cuối cùng vào lúc xuất chuồng (12 tuần tuổi). Lưu ý nên cân gà vào sáng sớm lúc trước khi cho gà ăn.
Theo dõi sự tiêu tốn thức ăn, tiến hành cân lượng thức ăn trước khi cho ăn, sau đó cộng toàn bộ lượng thức ăn của ngày hôm đó trừ đi lượng thức ăn thừa vào ngày hôm sau. Số lượng thức ăn theo từng ngày tuổi, được theo dõi ghi chép từ đó sẽ tính được lượng thức ăn mà đàn gà đã tiêu thụ.
3.6 Các chỉ tiêu theo dõi
+ Tỷ lệ gà có đáp ứng miễn dịch với virus Gumboro, qua kết quả kiểm tra ELISA. Số mẫu dương tính
Tỷ lệ huyết thanh dương tính (%) = x 100 Số mẫu xét nghiệm
+ Tăng trọng (g/con) = Trọng lượng cuối (g/con) – Trọng lượng đầu (g/con) + Tiêu tốn thức ăn, hệ số chuyển hoá thức ăn
Lượng thức ăn tiêu thụ Hệ số chuyển hoá thức ăn =
(kg thức ăn/kg tăng trọng) Tăng trọng
3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu thô được sử lý bằng phần mềm Excel.
So sánh trọng lượng, tiêu tốn thức ăn và hệ số chuyển hoá thức ăn giữa các nghiệm thức bằng phép thử t của phần mềm Minitab 16.
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả kiểm tra kháng thể
4.1.1 Khảo sát kháng thể thụ động mẹ truyền
Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể thụ động do mẹ truyền, được thể hiện qua bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kiểm tra kháng thể thụ động mẹ truyền Ngày tuổi Số mẫu
kiểm tra Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) Tỷ số S/P (X±SE) Hiệu giá kháng thể (X±SE) 3 5 5 100 0,81±0,30 1877±758 10 5 5 100 0,44±0,05 930±108 17 5 3 60 0,20±0,02 394±31 24 5 0 0 0,12±0,02 236±38
X: giá trị trung bình; SE: sai số chuẩn
Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy ở 3 ngày tuổi, 100% gà đều có kháng thể thụ động với hiệu giá kháng thể trung bình 1877 và lượng kháng thể duy trì đến 10 ngày tuổi. Tại thời điểm lúc gà 10 ngày tuổi tỷ lệ gà có kháng thể thụ động vẫn duy trì ở tỷ lệ cao 100%, mặc dù tại thời điểm này hàm lượng kháng thể đã giảm đáng kể chỉ bằng 1/2 so với lúc gà 3 ngày tuổi. Tuy nhiên với hiệu giá 930 vẫn đảm bảo miễn dịch chắc chắn cho gia cầm con. Vì theo tiêu chuẩn của bộ kit ELISA, với hiệu giá 396 qua xét nghiệm ELISA đã đủ miễn dịch bảo vệ cho đàn gà. Qua đó cho thấy việc tiêm phòng cho đàn gà mẹ, là rất cần thiết để tạo miễn dịch bảo hộ cho gia cầm con trong những ngày đầu.
Cũng từ kết quả bảng 4.1 cho thấy tại thời điểm 17 ngày tuổi, tỷ lệ dương tính với kháng thể mẹ truyền chỉ còn duy trì ở 60% gà thí nghiệm và hiệu giá giảm đáng kể chỉ còn 394 dưới ngưỡng bảo hộ (theo tiêu chuẩn bộ kit là 396) và đến 24 ngày tuổi kháng thể thụ động đã giảm hoàn toàn, hoặc một ít cá thể vẫn còn kháng thể nhưng rất thấp không phát hiện qua phản ứng ELISA. Theo Lê Văn Năm (2004), hàm lượng kháng thể thụ động trong cơ thể gà con phụ thuộc vào khoảng thời gian từ khi dùng vaccine cho gà mẹ đến khi lấy trứng ấp và hiệu giá kháng thể chủ động ở gà mẹ chuyển cho gà con.
động có thể bảo hộ đàn gia cầm con khi tiếp xúc với một số mầm bệnh sau khi mới nở tới 2 tuần. Qua đó cho thấy có sự khác nhau về sự tồn tại kháng thể thụ động giữa các đàn gia cầm, cho nên để công tác tiêm phòng đạt hiệu quả cần khảo sát sự tồn tại kháng thể mẹ truyền để có qui trình tiêm phòng thích hợp tránh bị ức chế miễn dịch do sự trung hoà vaccine với kháng thể thụ động. Theo Nguyễn Xuân Bình và ctv (2000), hiện nay qui trình tiêm phòng bằng vaccine cho gà con không có lịch rõ ràng và cũng không thể áp dụng lịch tiêm phòng chung cho tất cả mọi nơi.
4.1.2 Khảo sát mức độ bảo hộ của vaccine đối với virus gây bệnh Gumboro
Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch đối với vaccine Gumboro trên gà thí nghiệm được thể hiện qua bảng 4.2
Bảng 4.2 Mức độ bảo hộ của gà Tàu Vàng ở 35 ngày tuổi
Nghiệm thức Số mẫu kiểm tra Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) Tỷ số S/P (X±SE) Hiệu giá kháng thể (X±SE) NT1 7 0 0 0,11±0,02 212±34 NT2 7 0 0 0,03±0,02 46±29
NT1: sử dụng vaccine; NT2: không sử dụng vaccine; X: giá trị trung bình; SE: sai số chuẩn
Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy, sau khi tiêm vaccine Gumboro lần 2 được 14 ngày tương ứng với gà được 35 ngày tuổi, hầu hết gà đều chưa được miễn dịch mặc dù một số gà có đáp ứng miễn dịch nhưng với hiệu giá thấp, trung bình 212 với mức hiệu giá này chưa đủ bảo hộ đàn gà chống lại bệnh Gumboro. Với vaccine nhược độc thường cho đáp ứng miễn dịch nhanh, thông thường là 14 ngày sau tiêm phòng. Nhưng qua khảo sát trên cho thấy tại thời điểm này đáp ứng miễn dịch trên đàn gà rất thấp. Điều này có thể do vaccine cho đáp ứng miễn dịch chậm. Vì sự miễn dịch còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như cơ địa con vật và đặc tính của vaccine sử dụng.
Ở nghiệm thức đối chứng gà không được tiêm phòng vaccine hiệu giá kháng thể trung bình chỉ còn 46, không còn khả năng bảo hộ gà chống bệnh Gumboro theo tiêu chuẩn đánh giá của bộ kit ELISA. Theo Võ Thị Trà An và Võ Ngọc Bảo (2011), cần lưu ý rằng không phải kháng thể cứ xuất hiện trong máu là con vật được bảo vệ khỏi sự tấn công của mầm bệnh mà hàm lượng kháng thể phải đạt đến một trị số nhất định thì cơ thể mới có mức độ miễn dịch bảo vệ. Trị số kháng thể này được gọi là ngưỡng bảo hộ. Hàm lượng kháng thể càng cao hơn ngưỡng