Tách chiết DNA tiến hành theo Wiliam và cộng sự với một vài cải tiến cho phù hợp với đối tượng nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm.
Qui trình tách chiết và tinh sạch DNA được tiến hành theo các bước sau: -Sinh thiết được lấy ra từ Nitơ lỏng, sau đóđược nghiền bằng máy trong NaCl 0,9%.
- Cho thêm 400µl Lysis để phá vỡ tế bào. -Ủ mẫu ở nhiệt độ 560C-30‟
-Bổ sung 600µl phenol: choroform : isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hoà tan DNA. Lắc đều và ly tâm mẫu 13000 vòng/phút trong 20 phút. Khi đó protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha dịch DNA và pha phenol: choroform : isoamyl alcohol. Pha nước có chứa DNA sẽ được thu nhận lại bằng cách hút chuyển dịch sang ống eppendorf mới.
-Bổ sung 450µl chloroform: isoamyl alcohol rồi tiến hành các bước giống như khi cho phenol: chloroform vào. Cuối cùng thu được dịch chứa DNA.
- Dịch DNA thu được ở trên cho vào eppendorf chứa 850µl ethanol 100% và 40µl CH3COONa, đảo đều và để tủa trong ngăn đá qua đêm.
-Ly tâm 13000vòng/phút trong 20 phút, thu tủa DNA
-Rửa trong 400µl cồn 70% để loại bỏ muối và chloroform: isoamyl al- cohol còn sót lại trong mẫu.
-DNA thu được làm khô trong máy Speed Vac khoảng 10 phút. -Bảo quản DNA trong TE ở -12 oC
2.4.6. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Sau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, tiếp tục tiến hành phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
31
Nguyên tắc của phương pháp quang phổ kế
Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ = 260nm của các bazơ purine và pyrimidine. Dựa trên nguyên tắc này, cho phép xác định được nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách chiết.
- Nồng độ DNA
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm - Optical Density 260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan :
Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là : 50µg/ml cho một dung dịch sợi đôi.
Nồng độ tương đối của DNA được tính theo công thức :
C = OD260nm × d0 × So (1) C : Nồng độ tương đối của DNA
d0 : Độ pha loãng S0 : Hằng số, S0 = 50 - Độ sạch của DNA
Để kiểm tra độ sạch của DNA trong dung dịch, cần đo thêm OD ở 280nm đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các pro- tein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các DNA và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ DNA. Tiếp theo tính tỷ số OD260nm/OD280nm (2), DNA được xem là sạch khi tỷ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
2.4.7. Phƣơng pháp điện di trên gel Agarose
Nguyên tắc điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA tổng số, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
Acid nucleotide là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác động của điện trường.
32
Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm hiện hình bằng nhuộm. Đối với gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide, sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại. Khi điện di kiểm tra DNA, thường sử dụng thang DNA chuẩn cùng với mẫu nghiên cứu, từ đó có thể biết trọng lượng phân tử của các DNA khác nhau [35].
Các bước điện di được tiến hành như sau
- Đổ gel: Với DNA tổng số chuẩn bị gel 0,8%, sản phẩm PCR chuẩn bị gel 1,2%.
- Chuẩn bị mẫu cho vào từng giếng: Điện di DNA tổng số, tra 3µl mẫu đã trộn đều cùng 1µl loading dye. Với sản phẩm PCR, 6µl trộn với 1µl load- ing dye. Mix đều, rồi tra mẫu vào giếng điện di. Marker được sử dụng để xác định kích thước của DNA là marker lambda DNA/EcoRI + HindIII hoặc marker 1kb và 100bp cho sản phẩm PCR.
- Tiến hành điện di: Đặt các thông số cho điện di (hiệu điện thế U = 100V; thời gian khoảng 30 - 45 phút).
- Nhuộm ethidium bromide, đem soi dưới tia UV xem băng vạch, DNA bắt màu thuốc nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các băng vạch màu da cam, quan sát và chụp ảnh sản phẩm điện di.
2.4.8 Phƣơng Pháp PCR
Thành phần của phản ứng
Thành phần Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng 5,5
Master Mix 12,5
Primer 23S R 7pM 3
Primer 23S F 7pM 3
DNA mẫu 1
33
Các thành phần trên được trộn nhẹ nhàng trong ống eppendorf . Sau khi trộn đều, các ống eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng được xếp vào máy chu kỳ nhiệt. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Zhou Zheyang và cộng sự [36].
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Chu trình Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
1 Biến tính ban đầu 940C 3 phút
Biến tính 940C 30 giây
Gắn mồi 560C 30 giây
2 Lặp lại 40 chu kỳ Kéo dài mạch 720C 1 phút
Hoàn tất kéo dài
mạch 720C 8 phút
3 Kết thúc phản ứng 80C 10 phút →
∞
2.4.9. Phân tích trình tự đoạn gen 23S rARN
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng Bộ sinh phẩm QIAquick PCR Pu- rification của hãng Qiagen (Đức) và được giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc).
Kết quả giải trình tự của gen có thể mang lỗi như đọc thiếu nucleotide; không xác định được nucleotide... Vì vậy cần tiến hành phân tích những sai sót đó, căn cứ vào trình tự trên hai mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa hai mạch. Phân tích được thực hiện bằng chương trình Blast và Clustal -W Mul- tiple-Sequence Alignment Program, phiên bản 2.0.11
34
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung của các bệnh nhân
Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn được 30 bệnh nhân đồng thuận tham gia nghiên cứu. Có 17 bệnh nhân được xác định nhiễm H. pylori được điều trị bằng kháng sinh Clarithromycin và Amocicillin. Các bệnh nhân, sau điều trị quay lại lần hai để xét nghiệm sau 4-5 tháng
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Đồ thị 3.1 là sự phân bố tuổi tác của 17 bệnh nhân nhiễm H. pylori.
Trong số 17 bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu có 10 là nam chiếm 58.8% 7 là nữ chiếm khoảng 42, 12%. Sự phân bố tuổi tác bệnh nhân được biểu thị ở đồ thị N01 . Các bệnh nhân có tuổi thọ trung bình 41,64
Như vậy, các bệnh nhân có độ tuổi tập trung chủ yếu từ 29-50. Đây là lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực công việc, gia đình cũng như những thói quen sinh hoạt như hút thuốc, rượu chè...
3.1.2. Hình ảnh chụp nội soi dạ dày của các bệnh nhân
Hình ảnh nội soi dạ dày của 17 bệnh nhân cho thấy niêm mạc dạ dày bị phùnề, trượt và xuất huyết lan tỏa khắp niêm mạc. Các tổn thương thường nằm trên đỉnh các nếp gấp của niêm mạc dạ dày.
1 2 3 4 5
35
11 12 13 14 15
16 17
Hình 3.1. Ảnh chụp nội soi dạ dày xuất huyết của 17 bệnh nhân
3.2. Tách chiết DNA sinh thiết
Kết quả tách chiết DNA của các mẫu sinh thiết dạ dày của các bệnh nhân nhiễm H.pylori được trình bày trong hình 3.5. Như thấy trên hình 3.2, DNA tổng số được phân tách trên gel Agarose 1% hệ TAE cho một băng gọn, có kích thước khoảng 21,6 kb. Mẫu thu được không chứa RNA.
Hình 3.2. Ảnh điện di DNA tổng số
M: MarkerLambda DNA/EcoRI + HindIII 1-8: Một số mẫu DNA vi khuẩn
Tiếp theo, độ tinh sạch của mẫu DNA được xác định bằng đo OD ở hai bước sóng 280 và 280 nm. Kết quả đo cho thấy, các mẫu DNA có các giá trị C=OD260/OD280 biến thiên từ 1,82 - 2,00. Nồng độ DNA của mẫu nhận được
M 1 2 3 4 5 6 7 8
36 từ 2,2 µg/µl đến 2,9 µg/µl
Bảng 3.1. Độ sạch và nồng độ DNA của một số mẫu
TT Tên mẫu Độ sạch DNA (OD260 /OD280) Nồng độ DNA (µg/µl) TT Tên mẫu Độ sạch DNA (OD260 /OD280) Nồng độ DNA (µg/µl) 1 1A 1,91 2,80 19 9B 1,94 2,50 2 1B 1,85 2,75 20 10A 1,86 2,90 3 2A 1,86 2,80 21 10B 1,84 2,50 4 2B 1,89 2,58 22 11A 1,88 2,20 5 2C 1,88 2,46 23 11B 1,85 2, 39 6 3A 1,95 2,68 24 11C 1,75 2,20 7 3B 1,98 2,80 25 12A 1,96 2,50 8 4A 1,89 2,19 26 12B 1,87 2,40 9 4B 1,85 2,52 27 13A 1,92 2,20 10 5A 1,88 2,48 28 13B 1,98 2,70 11 5B 1,86 2,30 29 14A 1,86 2,40 12 6A 2,00 2,90 30 14B 1,96 2,35 13 6B 1,92 2,50 31 15A 1,82 2,40 14 7A 1,86 2,80 32 15B 1,98 2,20 15 7B 1,97 2,54 33 16A 1,86 2,50 16 8A 1,85 2,80 34 16B 1,84 2,70 17 8B 1,91 2,75 35 17A 1,80 2,30 18 9A 1,85 2,80 36 17B 1,81 2,50
3.3. Khuếch đại đoạn gen 23S rARN của H. pylori bằng PCR
DNA chiết xuất từ bệnh phẩm của 17 bệnh trước và sau điều trị kháng sinh được khuếch đại bằng cặp mồi 23S rARN bằng phương pháp PCR . Hình 3.3 giới thiệu một số kết quả nhận được.
Các phân tích điện di cho thấy, trong số 17 bệnh nhân có 10 người có kết quả PCR dương tính với H. pylori trước khi điều trị và âm tính vớiH. pylori
sau khi điều trị kháng sinh, trong khi đóH. pylori không được tiệt trừ trong 7 bệnh nhân có kết quả PCR dương tính cả trước và sau điều trị (bảng 3.2).
37
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR
M: Marker 100bp
1,2,3,4,5,6,8,10: Sản phẩm PCR (+) 6,9: Sản phẩm PCR (-)
Bảng 3.2. Kết quả khuếch đại gen 23S rARN từ DNA sinh thiết bệnh của các bệnh nhân trƣớc nhiễm H. pylori và sau khi điều trị kháng sinh Cla & Amo
A: Bệnh nhân xét nghiệm lần 1; B: Bệnh nhân quay lại lần 2; C: Bệnh nhân quay lại lần 3
1:Nam; 0: Nữ
TT Tên bệnh nhân Mã số tính, Giới
tuổi DNA PCR HPstatus 1 Nguyễn Thị H 1A 0 + + + 1B 39 + - - 2 Nguyễn Sỹ Q 2A 1 + + + 2B 41 + + + 2C + + + 3 Hoàng Thế Đ 3A 1 + + + 3B 46 + - - 4 Nguyễn Mạnh Nh 4A 1 + + + 4B 29 + - - 5 Nguyễn Thị L 5A 0 + + + 5B 48 - - - 6 Nguyễn Văn C 6A 1 + + + 6B 50 + + + 7 Trần Quốc K 7A 1 + + + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10
38 7B 37 + - - 8 Nguyễn Thị Nh 8A 0 + + + 8B 42 + + + 9 Lê Công V 9A 1 + + + 9B 33 + - - 10 Hoàng Thị Th 10A 0 + + + 10B 36 + - - 11 Mai Thị L 11A 0 + + + 11B 49 + + + 11C + + +
12 Nguyễn Văn X 12A 1 + + +
12B 39 + + + 13 Đoàn Thị H 13A 0 + + + 13B 42 + - - 14 Lê Thị O 14A 0 + + + 14B 35 + - - 15 Nguyễn Thành H 15A 1 + + + 15B 47 + - -
16 Bùi Phong Ph 16A 1 + + +
16B 46 + + +
17 Hoàng Xuân H 17A 1 + + +
17B 49 + - -
3.4. Xác định tái phát và tái nhiễm H. pylori ở các bệnh nhân
Đột biến A2143G trên gen 23S rARN ở các chủng H.pylori trước điều trị kháng sinh
Phân tích bệnh phẩm DNA của các bệnh nhân trước khi điều trị kháng sinh cho thấy, các chủng H.pylori của 10 bệnh nhân là chủng nguyên sinh không chứa đột biến A2143G trong đọan gen 23S rARN, trong khi đó 7 chủng
H.pylori của bệnh nhân chứa đột biến A2143G.
Các phân tích cũng cho thấy, tất cả các đột biến gây kháng Cla trên đoạn gen 23S rARN đều là A2143G. Như đã xác định bằng phương pháp PCR, H.pylori không chứa đột biến kháng Cla A2143G và có mức độ nhậy cảm khác nhau đối với Amoxicillin đã bị diệt trừ ở 11 bệnh nhân và không bị diệt trừ ở 6 bệnh nhân nhiễm, tái phátH,pylori mang đột biến A2143G .
39
2A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 288
5A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 276
6A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 276
8A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 104
11A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 336
12A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 277
16A ---ACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 334
1A ---ACCCGCGGCGAGACGGAAAAGA-CCCGTG---TACCTTTTTTACAAC--- 263
3A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 272
4A---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 336
7A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 104
9A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 104
10A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 342
13A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 275
14A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 274
15A ---ACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGG-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAA 336
17A AACACCCGCGGGGAGTCCCATCTGACTTGAAG-ACCTTTCTACGTACTTTTCACTGCAAA 278
Hình 3.4. Đột biến A2143G trong các chủng H. pylori trƣớc điều trị kháng sinh
3.5. Xác định tình trạng nhiễm H.pylori của các bệnh nhân trƣớc và sau điều trị kháng sinh điều trị kháng sinh
3.5.1. Đặt kháng sinh đồ
3.5.1.1 Kháng sinh đồ sử dụng thanh E-test trên đĩa thạch nuôi vi khuẩn
- Các vi khuẩn kháng Cla có MIC dao động từ 8 đến 248 µg/ml (hình 4)
- Trong rất nhiều trường hợp, không thể làm kháng sinh đồ do vi khuẩn bị nhiễm nặng các vi khuẩn khác cũng như không phát triển tiếp mà chỉ tồn tại ở dạng coccoid.
3.5.1.2. Xác định khả năng kháng Amoxicilin và Clarithromycin
- Tính kháng Amoxicilin của vi khuẩn H. pylori phân lập từ sinh thiết dạ dày được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ sử dụng thanh E-test. Các chủng H. pylori phân lâp có các mức độ kháng khác nhau đối với kháng sinh. Hình 3.5 là ảnh chụp hai phân tích kháng sinh đồ với Amoxicillin và
Clarithromycin và kết quả kháng Clarithromycin và nhạy với Amoxicilin
-Do các bệnh nhân bị bội nhiễm non-HP nhiều nên test kháng sinh đồ không tiến hành được hết
40
Hình 3.5: Đặt E-Test kháng sinh Clarithromycin và Amoxicilin
- Tỷ lệ là H. pylori kháng Clarithromycin 40,5%.
- Liên quan giới tính và H. pylori kháng Clarithromycin không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
3.5.1.3 Xác định tái phát và tái nhiễm của các chủng H.pylori sau điều trị kháng sinh
Bẩy chủng H.pylori mang đột biến A2143G có số phận khác nhau sau điều trị kháng sinh. Các chủng H. pylori kháng cả hai kháng sinh Cla và Amox không bị tiệt trừ và ở lại trong bệnh nhân gây tái nhiễm sau điều trị kháng sinh, trong khi đó các chủng H.pylori chỉ kháng Cla bị diệt trừ bởi Amox và bị thay thế bởi các chủng H. pylori tái nhiễm (Bảng 3.3 )
Bảng 3.3. Các chủng H.pylori sau điều trị kháng sinh Cla và Amox Chủng H. pylori Tính kháng với Cla và
Amox
Kết quả sau điều trị kháng sinh
2 ClaR AmoxR Tái phát
5 ClaRAmoxS Diệt trừ
6 ClaR AmoxR Tái phát
8 ClaR AmoxS Tái nhiễm
11 ClaR AmoxR Tái phát
12 ClaR AmoxR Tái phát
41
Hiện tƣợng tái phát và tái nhiễm sau điều trị đƣợc minh họa với từng chủng
H. pylori
- Bệnh nhân số 5 chủngH. pylori được diệt trừ do ClaRAmoxS
- Tái nhiễm2 bệnh nhân8, 16 sau điều trị kháng sinh Cla và Amox do chủngH. pylorikháng Cla và nhạy Amox.
- Tái nhiễm do H. pylori chủng 8 ClaR AmoxS
8A ATACATATTATGTATGGAGATGCTGAGACTCAGTCACTGTTGCCAACTCGTAAG-AGGAA 59 8B -GAACCATTCGGTACTGCGATGCTCAGACTCAGTCACT-TTGCCAACTCGTAAGGAGGAA 58 *.. ***. *** *.****** ************* *************** ***** 8A GTATAAGGTGTGACGCCTGCCCGGTGCTCGAAGGTTAAGAGGATGCGTCAGTCGCAAGAT 119 8B GTATAAGGTGTGACGCCTGCCCGGTGCTCGAAGGTTAAGAGGATGCGTCAGTCGCAAGAT 118 ************************************************************ 8A GAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGC 179 8B GAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGC 178 ************************************************************ 8A GAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTC 239 8B GAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTC 238 ************************************************************ 8A TCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGA 299 8B TCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGA 298 ************************************************************ 8A CGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATTATGCGCA 359 8B CGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATCATGCGCA 358 ****.*********************************************** *******
8A GGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTATGGGCTTTGGGTCTTATAGAGAGAGGGTTTGGGTCT 419