2.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu gồm:
Cốc sấy 40ml
Cốc thủy tinh 50ml, 100ml, 250ml, 500ml
Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
Ống nghiệm
Ống đong 100ml, 250ml
Phễu thủy tinh
Đũa thủy tinh
Bình tam giác 100ml, 250ml
Bình tia
Quả bóp cao su
Giấy lọc
2.2.2. Hóa chất
Nước cất (Trung tâm Thí nghiệm thực hành trường Đại học Nha Trang) DPPH (1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl) (Sigma-Aldrich, Mỹ)
Ethanol, acetone 99,5%, Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCl3COOH 10%, FeCl3 0,1% (là các hóa chất phân tích xuất xứ Trung Quốc tại cửa hàng hóa chất Hoàng Trang số 42-Hoàng Hoa Thám, TP. Nha Trang)
2.2.3. Thiết bị
Cân phân tích điện tử 4 chữ số, Shimadzu AY 120, Nhật.
Tủ sấy vuông, Trung Quốc.
Tủ lạnh LG 595 lít, model GR-S592 QTC/BSIPCTT, No 412 KRNMO 07503, Korea.
Bể ổn nhiệt Mammert Model WB29, Đức.
Máy votex
Máy đo quang phổ kế UV-Vis Carry 50.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Xác định điều kiện chiết tinh dầu Sả thích hợp (loại dung môi, nồng độ dung môi, thời gian chiết, nhiệt độ chiết, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi).
Xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tinh dầu Sả.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Nguyên liệu Sả được mua tại chợ Vĩnh Hải, TP. Nha Trang. Mẫu phải đảm bảo yêu cầu có cùng nguồn gốc, địa điểm mua, đồng đều về độ tươi và độ tuổi.
Mẫu sau khi mua đem về phòng thí nghiệm xử lý rửa sạch và xay nhỏ, tiến hành thực hiện thí nghiệm ngay.
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.4.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát chiết tinh dầu từ cây Sả
Sả
Lọc dịch Xử lý
Xay nhỏ
Chiết
- Loại dung môi - Nồng độ dung môi - Thời gian
- Nhiệt độ
- Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
Dịch chiết tinh dầu Sả
Giải thích
− Sả: mua tại chợ Vĩnh Hải, TP. Nha Trang
− Xử lý: loại bỏ lá, lấy phần thân khoảng 5 - 7cm phục vụ cho việc làm thí nghiệm và loại bỏ tạp chất bằng nước sạch. Sau đó, thái nhỏ cỡ 0,3 – 0,5cm để dễ dàng cho công đoạn xay nhỏ tiếp theo.
− Xay nhỏ: nguyên liệu xay nhỏ với mục đích tăng diện tích tiếp xúc với dung môi chiết làm tăng khả năng khuếch tán, thẩm thấu của các chất từ nguyên liệu vào dung môi, từ đó làm tăng hiệu suất tách chiết.
− Chiết: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết bao gồm có: loại dung môi, nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi.
− Lọc dịch: thu nhận phần dịch chiết tinh dầu Sả, loại bỏ bã.
2.4.2.2. Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Loại dung môi chiết ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết. Một số nhà khoa học nghiên cứu chiết xuất tinh dầu Sả với dung môi ethanol [21]; một nghiên cứu khác chiết bằng dung môi là nước lạnh và nước nóng cho thấy dịch chiết khi chiết bằng nước nóng có khả năng chống oxy hóa tốt hơn so với nước lạnh [20]. Để khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ Sả, tiến hành với 3 loại dung môi là ethanol, acetone, nước sôi theo sơ đồ Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Cách tiến hành:
Sả sau khi mua về được rửa sạch sơ bộ, thái nhỏ và sau đó đem đi xay nhỏ. Tiến hành chiết với 3 loại dung môi khác nhau là: ethanol, acetone, nước nóng. Dung môi dùng trong thí nghiệm là tuyệt đối. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi cố định là 1/15 tương ứng với 2g sả chiết với 30ml dung môi. Thời gian chiết là 4h. Sau đó, tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu được dịch lọc, bổ sung thêm dung môi chiết vào dịch lọc cho đúng bằng thể tích ban đầu là 30ml rồi đem dịch chiết đi xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Dịch chiết
Phân tích khả năng chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do
- Tổng năng lực khử
Chọn loại dung môi thích hợp Lọc Sả Xử lý Xay Nước sôi Ethanol Chiết Aceton
- Nồng độ dung môi: tuyệt đối
- NL/ DM: 1/15 - Thời gian: 4h - Nhiệt độ phòng
Dựa vào kết quả xác định khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử, lựa chọn được loại dung môi thích hợp để thu được dịch chiết tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
2.4.2.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Nồng độ dung môi chiết là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết. Xác định nồng độ dung môi chiết, tiến hành như sơ đồ được bố trí trong Hình 2.3
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
50%
40% 60% 70% 80%
Dịch chiết Lọc
Phân tích khả năng chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do - Tổng năng lực khử Chọn nồng độ dung môi thích hợp Sả Xử lý Xay Chiết - Dung môi: TN1 - NL/DM: 1/15 - Thời gian: 4h - Nhiệt độ phòng
Cách tiến hành:
Nguyên liệu Sả sau khi đã xử lý sơ bộ đem xay nhỏ. Sau đó, cho vào 5 cốc thủy tinh có nắp đậy, mỗi lọ cho vào 2g nguyên liệu. Tiến hành cho dung môi có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở TN1. Lượng dung môi bổ sung cố định là 1/15 (2g Sả cho 30ml dung môi). Dung môi được pha lần lượt ở các nồng độ khác nhau: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. Sau đó, đậy nắp lại và đem chiết ở nhiệt độ phòng trong thời gian 4h. Tiến hành lọc lấy dịch lọc và bổ sung thêm dung môi chiết vào các cốc cho bằng thể tích ban đầu là 30ml.
Tiến hành đem dịch chiết đi xác định hoạt tính chống oxy hóa. Dựa vào kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử, lựa chọn được nồng độ thích hợp để thu được dịch chiết tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
2.4.2.4. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Thời gian chiết ảnh hưởng lớn đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết. Thời gian dài hay ngắn sẽ thu được dịch chiết có khả năng chống oxy hóa khác nhau. Tiến hành xác định thời gian chiết tốt nhất, thực hiện với các mốc thời gian như Hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Dịch chiết Lọc
Phân tích khả năng chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do
- Tổng năng lực khử
Chọn thời gian chiết thích hợp 2h 0.5h 1h 4h 6h 8h 10h Sả Xử lý Xay Chiết - Dung môi: (TN1) - Nồng độ DM: (TN2) - NL/DM: 1/5 - Nhiệt độ phòng
Cách tiến hành:
Sả sau khi xay nhỏ ta cho 2g vào lọ thủy tinh, cho dung môi đã chọn ở TN1, nồng độ dung môi ở TN2 và tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/5. Sau đó, đậy nắp lại và đem đi chiết ở nhiệt độ phòng trong thời gian 0.5h. Sau đó đi lọc lấy dịch lọc và bổ sung thêm dung môi chiết sao cho đúng bằng thể tích ban đầu. Sau đó, đem dịch chiết đi xác định khả năng chống oxy hóa.
Tiến hành làm các thí nghiệm tương tự nhưng thời gian thay đổi như trong sơ đồ bố trí thí nghiệm trên.
Dựa vào kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử, lựa chọn được thời gian thích hợp để thu được dịch chiết tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
2.4.2.5 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết là nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ chiết yếu tố quan trọng cần chú ý đến là sự bay hơi và điểm sôi của dung môi chiết. Thí nghiệm được thực hiện bằng dung môi acetone, acetone là một dung môi dễ bay hơi ngay khi ở nhiệt độ thường và điểm sôi là 560C. Nếu chiết ở nhiệt độ lớn hơn điểm sôi của dung môi, hàm lượng dung môi sẽ bay hơi và không đủ dung môi để chiết những hợp chất từ nguyên liệu ra bên ngoài dung môi dẫn đến hiệu suất chiết giảm.
Hầu hết các tinh dầu đều kém bền nhiệt và nhiệt độ cao sẽ làm phân hủy tinh dầu. Hơn nữa, nghiên cứu của các nhà khoa học đã chỉ ra rằng trong tinh dầu của cây Sả có thành phần chủ yếu là citral. Nghiên cứu đã chứng minh citral là một chất nhạy cảm và dễ bay hơi [22]. Một nghiên cứu khác của David E. Sasser cho thấy citral bao gồm geraniol và netral là hợp chất có nhiệt độ sôi thấp [11].
Vì thế, bố trí nhiệt độ ở nhiệt độ thường, 400C và 500C để tránh sự bay hơi của dung môi và tinh dầu. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ Sả được bố trí như Hình 2.5, tiến hành làm thí nghiệm như bố trí để theo dõi sự biến đổi.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Cách tiến hành:
Sả sau khi xay nhỏ cho 2g vào lọ thủy tinh, cho dung môi với nồng độ, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi và thời gian chiết đã xác định ở các thí nghiệm trên. Tiến hành chiết với nhiệt độ lần lượt là t0 thường, 400C, 500C. Sau đó đem các mẫu đi lọc và bổ
Dịch chiết
Phân tích khả năng chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do - Tổng năng lực khử Chọn nhiệt độ chiết thích hợp Lọc t0 thường 400C 500C Sả Xử lý Xay Chiết - Dung môi: (TN1) - Nồng độ DM: (TN2) - NL/DM: 1/5 - Thời gian: (TN3)
sung dung môi chiết sao cho đúng bằng thể tích ban đầu. Tiến hành xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết.
Dựa vào kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử, lựa chọn được nhiệt độ thích hợp để thu được dịch chiết tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
2.4.2.6. Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ảnh hưởng rất lớn đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết. Lượng nguyên liệu và dung môi cần được xác định để thu được dịch chiết có khả năng chống oxy hóa tốt nhất bằng cách thực hiện theo sơ đồ bố trí thí nghiệm như hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Chọn tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi thích hợp
Dịch chiết Lọc
Phân tích khả năng chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do - Tổng năng lực khử Sả Xử lý Xay Chiết - Dung môi: (TN1) - Nồng độ DM: (TN2) - Thời gian: (TN3) - Nhiệt độ: (TN4) 1/20 1/10 1/30 1/40 1/50
Cách tiến hành:
Nguyên liệu Sả xay nhỏ sau đó cho 2g vào lọ thủy tinh, cho dung môi đã chọn qua TN1 và nồng độ đã chọn qua TN2 vào với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/10 rồi đậy kín nắp lại. Tiến hành đem chiết ở nhiệt độ phòng đã chọn ở TN4, bổ sung thêm dung môi chiết sao cho bằng thể tích ban đầu và đem dịch chiết đi xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Tiến hành làm tương tự như trên nhưng thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi như sơ đồ bố trí thí nghiệm trên.
Dựa vào kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử, lựa chọn được tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi thích hợp để thu được dịch chiết tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.
2.4.3. Các phương pháp phân tích
2.4.3.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được phân tích theo phương pháp của Fu và ctv (2002). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1a.
2.4.3.2. Phương pháp phân tích tổng năng lượng khử
Tổng năng lượng khử được phân tích theo phương pháp của Fu và ctv (2002). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1b.
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê trên phần mềm SPSS 16.0 tiêu chuẩn kiểm định Tukey, Ducan,… được sử dụng và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả oxy hóa của dịch chiết từ cây Sả
Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây Sả được trình bày trên đồ thị Hình 3.1 và 3.2
Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ cây Sả
a b a 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
ETHANOL ACETONE NƯỚC
Nồng độ DPP H bị kh ử (m M/m l) Dung môi
Hình 3.2. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ cây Sả
Chú thích: Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa (P<0,05)
Kết quả trên đồ thị Hình 3.1 và 3.2 cho thấy: khả năng chống oxy hóa của dịch chiết phụ thuộc rất nhiều vào loại dung môi chiết. Kết quả nhìn chung cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử có mối tương quan khá cao (khi xử lý bằng tiêu chuẩn Paired simples T-Test). Dịch chiết khi chiết bằng dung môi acetone có khả năng chống oxy tốt hơn so với khi chiết bằng dung môi ethanol và nước nóng. Phân tích Anova để so sánh sự khác biệt giữa các dung môi, các tiêu chuẩn kiểm định Tukey HSD, Tukey B, Ducan,… đều đưa ra kết quả tương đồng nhau là dịch chiết khi chiết bằng dung môi ethanol và nước nóng không có sự khác biệt (P>0,05), dịch chiết khi chiết bằng dung môi acetone cho khả năng chống oxy hóa cao nhất (P<0,05). Cụ thể, chiết bằng dung môi ethanol và nước nóng thu được dịch chiết có khả năng khử gốc tự do chỉ đạt ở khoảng 0,2522 mM/ml ÷ 0,2802 mM/ml và
a b a 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18
ETHANOL ACETONE NƯỚC NÓNG
Độ h ấp th ụ đo ở bước sóng 700nm Dung môi
tổng năng lực khử đạt giá trị OD là 0,0914 ÷ 0,0898. Trong khi đó, dịch chiết khi chiết bằng dung môi acetone cho dịch chiết có khả năng khử gốc tự do cao nhất là 0,5845 mM/ml và tổng năng lực khử cao nhất đạt giá trị OD là 0,1498.
Hằng số điện môi của một chất phản ánh sơ bộ tính chất phân cực của một chất. Tính phân cực mạnh của nước được lấy làm chuẩn có hằng số điện môi là 80,10 (20 °C ), dung môi acetone là 20,7 và ethanol là 24,55. Các dung môi có hằng số điện