2.2.1. Thiết kế nghiên cứu:
Nghiên cứu tiền cứu, cắt ngang, mơ tả và phân tích nhằm khảo sát phân bố VK gây bệnh qua CĐL dịch rửa PQ-PN, tình hình đề kháng KS của VK ở BN viêm phổi nặng thở máy. Dữ liệu được phân tích chung, và phân tầng ở 2 nhĩm: VPLQCSYT, VPMPCĐ với VPMPCĐ là nhĩm chứng. Để xác định độ đồng thuận trong chẩn đốn VK của CĐL dịch khí quản, CĐL dịch rửa PQ-PN được chọn làm cơ sở để so sánh.
2.2.2. Mơ hình nghiên cứu:
Viêm phổi nặng thở máy
- Lâm sàng;
- X-quang phổi thẳng, KMĐM
- Cĩ chỉ định thở máy xâm lấn
BN đủ tiêu chuẩn thu dung, khơng tiêu chuẩn loại trừ (n=138)
Chụp X-quang phổi nghiêng phải hoặc trái (tại giường) Hút DKQ
Gởi Khoa vi sinh soi nhuộm Gram, CĐL VK
(≥105 CFU/mL), KSĐ;
soi, cấy tìm VK lao
Soi phế quản, rửa PQ- PN, thu thập bệnh phẩm
Gởi Khoa vi sinh soi nhuộm Gram, CĐL VK
(≥104 CFU/mL), KSĐ;
soi, cấy tìm VK lao Điều trị KS
theo phác đồ
Kết quả soi nhuộm Gram, CĐL VK,
KSĐ dịch rửa PQ-PN dịch rửa PQ-PN
Kết luận
Đánh giá đổi KS theo KSĐ Kết quả nghiên cứu Đánh giá độ đồng thuận về phân lập VK VPMPCĐ (n=92) VPLQCSYT (n=46)
2.2.3. Cỡ mẫu:
BN được thu dung vào nghiên cứu khi thỏa mãn tiêu chuẩn chẩn đốn viêm phổi nặng thở máy, nhập viện từ khu vực cộng đồng, khơng tiêu chuẩn loại trừ. BN sẽ được nội soi phế quản ống mềm, rửa PQ-PN, CĐL
VK. Theo Chastre J. et al (1995), độ nhạy của CĐL VK dịch rửa PQ-PN
(≥104 CFU/ml) ở BN viêm phổi thở máy, khi so sánh với CĐL VK mơ phổi
viêm qua tử thiết (≥104 CFU/1 gram mơ) là 91% [50]. Với tỷ lệ này thì cỡ
mẫu được xác định:
n = Z2
1-α/2 p (1-p) / d2
Với: α (sai lầm loại 1) = 0,05 => Z1-α/2 = 1,96;
p = 91% (Tỷ lệ phân lập VK (+) qua rửa PQ-PN/Viêm phổi);
d = 5% (Sai số cho phép);
=> Số bệnh nhân cần thiết cho nghiên cứu: n = 126.
2.2.4. Phương tiện nghiên cứu: Gồm các trang thiết bị như sau:
a. Máy thở: VELA thuộc T Bird series, Model 16186 07; b. Ống nội khí quản (NKQ) cĩ đường kính trong 8 mm;
c. Ống nội soi: OLYMPUS Portable LF-PT đường kính 5,1 mm;
d. Ống tiếp nối vơ trùng: là một đoạn ống thở rời, nối tiếp giữa ống thở của máy thở với đầu ngồi ống nội khí quản (NKQ). Tại đầu gắn với NKQ, ống tiếp nối cĩ nắp đậy bằng cao su, trên đĩ cĩ lỗ dành cho nút cài- mở. Khi mở nút cài, cĩ thể luồn ống soi phế quản qua lỗ (lỗ ơm vừa khít ống soi), vào NKQ xuống đường hơ hấp dưới, thực hiện thủ thuật;
f. Nhiều ống nghiệm vơ trùng 20ml, chuyên dụng, gắn giữa hệ thống hút với ống soi, để thu thập bệnh phẩm;
g. Dung dịch NaCl 9 ‰ 150 ml để rửa PQ-PN;
h. Găng vơ trùng, nguồn O2, máy hút, bơm tiêm…
2.2.5. Nội dung nghiên cứu:
Nghiên cứu được thực hiện theo các bước sau:
2.2.5.1. Điều trị ban đầu:
* Các trường hợp chẩn đốn viêm phổi nặng, suy hơ hấp, cĩ chỉ định thơng khí cơ học xâm lấn sẽ được đặt NKQ, thở máy;
* Thiết lập đường truyền tĩnh mạch trước hoặc ngay sau tiến trình đặt NKQ, thở máy;
* An thần, giãn cơ đầy đủ;
* Mắc Monitor theo dõi dấu hiệu sinh tồn: M, HA, SpO2 , điện tim;
* Thực hiện các xét nghiệm thường qui: KMĐM, CTM, cấy máu, huyết thanh chẩn đốn vi khuẩn khơng điển hình, đường huyết, SGOT- SGPT, BUN-Creatinine/máu, ion đồ/máu, protein/máu, albumin/máu, huyết thanh chẩn đốn HIV (nếu nghi ngờ), điện tâm đồ.
2.2.5.2. Thu dung bệnh nhân: theo tiêu chuẩn chọn bệnh.
2.2.5.3. Giải thích người nhà bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu. 2.2.5.4. Chụp X-quang phổi nghiêng phải hoặc trái (tại giường):
Sau khi ổn định cài đặt thở máy qua NKQ, dựa vào tổn thương trên X- quang phổi thẳng ở phế trường bên phải hoặc trái, để chọn lựa bên chụp nghiêng tương ứng, nhằm xác định phân thùy phổi cần rửa PQ-PN.
2.2.5.5. Midazolam 5 mg: ½ đến 1 ống chích tĩnh mạch, tùy tình trạng thức tỉnh, bảo đảm BN ngủ yên trong quá trình rửa PQ-PN.
2.2.5.6. Tăng FiO2 lên 80-100% nhằm đưa SpO2 lên 95-100% trong quá
trình soi phế quản. Điều chỉnh FiO2về lại mức cũ trước đĩ, bảo đảm PaO2
≥ 60 mmHg.
2.2.5.7. Hút dịch khí quản: Luồn xơng hút đàm qua nội khí quản vào khí
quản, bơm 5-10 ml NaCL 9‰ sau đĩ hút ra ống nghiệm vơ trùng, gởi cấy
định lượng VK. Mẫu bệnh phẩm chứa ít nhất 2 mL.
2.2.5.8. Soi phế quản và lấy bệnh phẩm:
Luồn ống soi mềm qua ống NKQ, đến phân thùy phổi cĩ tổn thương thực thể, đã định hướng trên X-quang phổi thẳng, nghiêng. Thực hiện rửa PQ-PN bằng cách bơm 120 ml NaCl 9‰ vào phân thùy phổi tương ứng, sau đĩ hút dịch rửa ra các ống nghiệm.
Kiểm tra lại tồn bộ phế quản 2 bên, hút sạch đàm và dịch cịn thừa. Nếu tắc đàm nhiều, tiến hành rửa phế quản điều trị ngay sau đĩ.
Những ca khơng thể chụp X-quang phổi nghiêng, hoặc tổn thương phổi lan tỏa, rửa PQ-PN thực hiện tại phân thùy phổi đang cĩ nung mủ, tăng tiết.
2.2.5.9. Điều trị KS:
Kháng sinh được thực hiện theo phác đồ chung hiện hành tại khoa: + Phối hợp Cefoperazone/Sulbactam: 1g x 2 lần/ngày và Levofloxacin: 0,75g/ ngày; Vancomycin (nếu nghi ngờ do tụ cầu vàng).
+ Trường hợp suy thận, sử dụng Ceftriaxone: 2g/ngày, và điều chỉnh liều Levofloxacin, Vancomycin phù hợp độ thanh thải Creatinin.
2.2.5.10. Theo dõi:
Trong quá trình nội soi, BN được theo dõi sát: mạch, huyết áp, SpO2.
Chỉ tiến hành khi sinh hiệu ổn định, SpO2 ≥ 90%. Thân nhiệt và các thơng
số trên tiếp tục được theo dõi trong 6 giờ sau thủ thuật nội soi phế quản. Các bước trong nội dung nghiên cứu như: chụp X-quang phổi tại giường (thẳng, nghiêng), các xét nghiệm vi sinh, sinh hĩa nhờ sự hỗ trợ của khoa Chẩn đốn hình ảnh, khoa Vi sinh, khoa Sinh hĩa-Huyết học bệnh viện Phạm Ngọc Thạch. Các bước cịn lại như: nội soi phế quản, rửa PQ- PN, hút DKQ do nghiên cứu sinh trực tiếp thực hiện. Bên cạnh cịn cĩ sự hỗ trợ của các Bác sĩ, Điều dưỡng trong khoa qua việc theo dõi, chăm sĩc, điều trị BN.
2.2.6. Quy trình xử lý bệnh phẩm và cấy định lượng [7]:
DKQ, dịch rửa PQ-PN được gởi đến khoa Vi sinh bệnh viện Phạm Ngọc Thạch trong vịng 60 phút. Sau khi trộn đều, bệnh phẩm được chia thành 2 phần: 1 phần gởi đến labo VK lao (nhuộm Ziehl Neelsen và cấy tìm VK), 1 phần xử lý tiếp ở labo VK ngồi lao (soi tươi và nhuộm mực tàu: tìm nấm, ký sinh trùng; soi nhuộm Gram và cấy định lượng).
2.2.6.1. Quy trình xử lý và cấy định lượng VK DKQ [7]:
DKQ được xử lý theo các bước như sau:
- Pha DKQ thu hồi được với lượng ít thuốc tan đàm;
- Ủ 37oC trong 30 phút, trộn đều cho tan;
- Hút 0,5ml bệnh phẩm pha lỗng trong 4,5mL dung dịch nước cất vơ trùng, thực hiện 2 lần (pha lỗng 1/10, 1/100);
- Chia đơi BA (Blood agar) (thạch máu cừu), BA gentamycin (nếu
cĩ), MC (Thạch Mac-Conkey), CAHI (Chocolat Agar Hemophillus
Influenzae) làm 2, một bên ghi “0”, một bên ghi: “1”;
- Cấy 10 µl DKQ pha lỗng 1/10 sau khi ủ vào thạch BA, MC, CAHI bên “0”;
- Cấy 10 µl DKQ pha lỗng 1/100 vào thạch BA, MC, CAHI bên “1”;
- Ủ 37oC/24 giờ. Riêng BA, CAHI ủ trong bình nến;
- Đọc kết quả bên “1”: cĩ ≥ 10 khúm trùng cùng loại, tiến hành
định danh và làm kháng sinh đồ (KSĐ);
- Nếu bên “1” cĩ < 10 khúm trùng, xem bên “0”, nếu cĩ khoảng 100 khúm thì vẫn tiến hành làm KSĐ và định danh;
- Lượng VK khi tính ngược lại sẽ là ≥10 5 CFU/ml DKQ;
- Kết quả cấy định lượng DKQ (+) khi lượng VK ≥ 10 5 CFU/ml.
2.2.6.2. Quy trình cấy định lượng VK dịch rửa PQ-PN [7]:
Dịch rửa PQ-PN được xử lý theo các bước: - Lắc đều bệnh phẩm;
- Lấy 0,5 ml dịch rửa cho vào 4,5 ml dung dịch pha lỗng vơ trùng
(pha lỗng 1/10 =10-1);
- Chia đơi BA (Blood Agar) (thạch máu cừu), BA gentamycin
(nếu cĩ), MC (thạch Mac-Conkey), CAHI (Chocolat Agar Hemophillus
influenzae) thành 2 phần, một bên ghi = “0”, một bên = “1”;
- Cấy 10 µl dịch rửa PQ-PN vào thạch BA, MC, CAHI bên “0”; - Cấy 10 µl dịch rửa PQ-PN pha lỗng 1/10 vào thạch BA, MC,
- Ủ 37oC/24 giờ. Riêng BA, CAHI ủ trong bình nến;
- Đọc kết quả bên “1”: cĩ ≥ 10 khúm vi khuẩn cùng loại, tiến
hành định danh và làm KSĐø;
- Nếu bên “1” cĩ < 10 khúm trùng thì xem bên “0”, nếu cĩ khoảng 100 khúm thì vẫn thực hiện làm KSĐø và định danh;
- Lượng VK khi tính ngược lại sẽ là ≥10 4 CFU/ml dịch rửa PQ-PN
(CFU: Colony-forming Units);
- Kết quả cấy định lượng dịch rửa PQ-PN dương tính khi lượng vi
khuẩn ≥ 104 CFU/mL.
2.2.6.3. Qui trình thực hiện kháng sinh đồ [7]:
- Chọn VK mới mọc trong vịng 24 giờ;
- Pha huyền dịch VK bằng độ đục Macfarland 0.5;
- Pha trong nước muối hoặc nước cất vơ khuẩn, riêng S. pneumoniae,
Hemophilus và Neisseria pha trong mơi trường BHI (Brain Heart Infusion); - Dùng tăm bơng vơ khuẩn nhúng vào huyền dịch VK, sau đĩ ép nhẹ tăm bơng lên thành lọ cho hơi khơ đầu tăm bơng;
- Phết đầu tăm bơng lên bề mặt hộp thạch theo 4 chiều, từ trung tâm ra ngồi, để khơ bề mặt từ 3-5 phút, nhưng khơng quá 15 phút;
- Dùng kẹp đặt đĩa KS lên mặt thạch (khoảng cách 2 đĩa tối thiểu 20 mm, từ bờ tới bờ). Tối đa là 7 đĩa trên mỗi hộp thạch 100 mm;
- Đặt đĩa KS tùy theo loại VK và bệnh phẩm theo “Sơ đồ đặt đĩa KS”; - KS khuếch tán ngay sau khi đĩa KS chạm mặt thạch, do đĩ khơng dời chỗ đĩa KS sau khi đã đặt lên mặt thạch;
- Trong vịng 15 phút sau khi đã đặt đĩa KS, ủ ngược hộp thạch, đáy lên
trên và cho vào tủ ủ 370C trong 24 giờ;
- Đọc kết quả: sau khi ủ 24 giờ, tiến hành đo đường kính vịng vơ khuẩn và đọc kết quả KSĐ theo tiêu chuẩn CLSI (The Clinical and Laboratory Standards Institute).
2.2.6.4. Qui trình định danh VK [7]:
Định danh VK bằng bộ Test IDS 14 GNR (bộ định danh VK Gram âm dễ mọc), theo các bước như sau:
- Chuẩn bị VK: VK từ hộp thạch phân lập phải được cấy thuần khiết
sang mặt thạch dinh dưỡng, khơng cĩ chất ức chế, và phải ủ ở 35-370C trong
thời gian từ 8-24 giờ, để cĩ được một lớp VK mọc thấy được trên mặt thạch. - Thực hiện định danh với IDS 14 GNR (hình minh họa phần phụ lục 5):
+ Thực hiện thử nghiệm tìm Oxidase: quệt một vịng cấy khúm VK trẻ khơng quá 24 giờ lên đĩa giấy Oxidase đã tẩm ướt bằng nước muối sinh lý. Đọc kết quả trong vịng 10 giây đến 1 phút đầu. Nếu quệt chuyển màu tím là (+), khơng đổi màu là (-);
+ Thực hiện thử nghiệm tìm LDC và di động: Dùng kim cấy vơ khuẩn chạm vào khúm VK thử nghiệm trên mặt thạch đặc, cấy đâm thẳng đứng vào chính giữa ống mơi trường LDC và di động, sau đĩ đậy nắp lại bằng
mủ nhựa đi kèm. Ủ 35-370C qua đêm đến tối đa 24 giờ. Đọc kết quả Lysin
decarboxylase và di động trên mơi trường;
+ Thực hiện thử nghiệm sinh hĩa trên bản nhựa: làm một huyền dịch VK thuần khiết đã chuẩn bị ở bên trong 3-5 mL nước muối sinh lý vơ khuẩn, pha càng đục càng tốt. Dùng micropipette với đầu tips vơ khuẩn hút 200 µl
huyền dịch VK cho vào mỗi giếng trên bản nhựa. Đậy nắp bản nhựa lại và ủ
trong tủ ấm 35-370C. Đọc kết quả sau khi ủ qua đêm (khoảng 12-16 giờ),
khơng nên quá 16 giờ. Riêng thử nghiệm ONPG, cĩ thể đọc kết quả thử nghiệm sau ủ 2 giờ, và kiểm tra lại sau 6 giờ;
+ Đọc kết quả sinh hĩa trên bản nhựa, tra bảng mã định danh để định danh VK.
2.2.6.4. Qui trình xác định VK tiết ESBL [7]:
Quá trình thực hiện KSĐ theo kỹ thuật đĩa giấy khuếch tán trong thạch, đĩa KS được sắp xếp để phát hiện các chủng VK tiết ESBL theo phương pháp “đĩa đơi” và “đĩa kết hợp” theo qui trình sau:
- Đặt đĩa giấy AMC (amoxillin 20 µg/clavulanic acid 10 µg) ở trung tâm; - Xung quanh đĩa giấy AMC sẽ đặt các khoanh giấy cephalosporin thế hệ 3,4: CTX (cefotaxime) 30 g, CRO (ceftriaxone) 30 g, CAZ (ceftazidim) 30 g và FEP. Sau đĩ đặt ceftazidim–clavulanic acid (30– 10 g), cefotaxime–clavulanic acid (30–10 g) trên cùng một hộp thạch;
- Các khoanh giấy này cách nhau 20-25 mm, và cách rìa đĩa thạch 15 mm, mặt khoanh giấy phải được áp sát và tiếp xúc đều trên mặt thạch.
- Để ở nhiệt độ phịng 30 phút cho KS khuếch tán vào thạch;
- Để tủ ấm 35-37 0C trong 18-24 giờ;
- Đọc kết quả để phát hiện các chủng VK cĩ tiết ESBL: nếu vịng vơ
khuẩn quanh khoanh KS β-lactam phổ rộng tăng kích thước mở rộng về
phía khoanh AMC (vịng vơ khuẩn méo mĩ, hình elip, hoặc xuất hiện một
vùng vơ khuẩn giữa khoanh KS β-lactamase phổ rộng và khoanh AMC,
chênh lệch đường kính vịng vơ khuẩn của 2 đĩa KS: đĩa cĩ clavulanate
đường kính vịng vơ khuẩn ≥ 50% hoặc ≥ 5mm so với đĩa β-lactam phổ
rộng tương ứng khơng cĩ clavulanate thì VK đĩ được xác định là cĩ ESBL.
VK chứng: K. pneumoniae ATCC 700603 (chứng dương) và E. coli ATCC
25922 (chứng âm).
Các thao tác, kỹ thuật xử lý, đọc kết quả VK DKQ, dịch rửa PQ-PN được thực hiện trực tiếp bởi bác sĩ chuyên khoa Vi sinh Mai Nguyệt Thu Huyền, kỹ thuật viên vi sinh Lê Quốc Thu Vân, dưới sự giám sát của Tiến sĩ Nguyễn Thị Ngọc Lan đang cơng tác tại khoa Vi sinh BV Phạm Ngọc Thạch.
2.2.7. Huyết thanh chẩn đốn vi khuẩn khơng điển hình:
Huyết thanh chẩn đốn vi khuẩn khơng điển hình được làm theo phương
pháp ELISA với các kit Clamydophila pneumoniae IgM, Clamydophila
pneumoniae IgG, Mycoplasma pneumoniae IgM, Mycoplasma pneumoniae
IgG, Legionella pneumophila IgM, Legionella pneumophila IgG của cơng ty
Vircel (Tây Ban Nha). Huyết thanh chẩn đốn được lập lại 14 ngày sau đĩ.
Chuyển đổi huyết thanh cĩ ý nghĩa chẩn đốn khi IgG lần II tăng ≥ 4 lần so
với lần I, hoặc bất kỳ thời điểm nào cĩ sự hiện diện của IgM.