V. THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE
b. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel
Mục đích: tách các protein ra khỏi nhau để thu được enzyme tinh khiết. Nguyên tắc
Phương pháp này được ứng dụng để tách hỗn hợp các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng.
Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thông qua sự tương tác của 2 pha:
- Pha tĩnh là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngoài hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng cách rửa qua dung dịch đệm.
- Pha động là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm.
Phương pháp thực hiện
Dùng cột sắc ký nhồi chất mang là sephadex tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Chất nào có phân tử lượng lớn không bị mắc kẹt trong các lỗ rây của cột nhồi sẽ chạy ra trước ta thu được nhưng phân đoạn đầu tiên và ngược lại những chất có phân tử lượng nhỏ nhất sẽ chạy ra sau cùng. Từ đây, ta thu được ta thu được các phân đoạn khác nhau.
Thiết bị
Hiện nay, người ta thường sử dụng gel sephadex làm vật liệu nhồi cột. Sephadex khi ngâm trong nước sẽ hình thành nên mạng lưới gel ba chiều.
Các loại sephadex hiện nay chỉ trương nở trong nước và một vài dung môi phân cực nhưng không trương trong methanol, ethanol, acid acetic. Sephadex không tương tác với các ion do nó trung hòa về điện. Nếu bị oxy hóa mạnh trong các dung dịch thì cấu trúc gel sẽ bị phá vỡ, còn trong trong dung dịch acid mạnh thì các glucoside trong gel sẽ bị thủy phân.
Hình14. Sự phân tách các phân tử protein –enzyme bằng kĩ thuật sắc kí ái lực
Đánh giá hiệu quả quá trình tinh sạch:
Đánh giá hoạt tính riêng của chế phẩm: Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme chủ yếu dựa vào lượng tinh bột bị thủy phân hay lượng đường khử tạo thành, sau đây là một số phương pháp để xác định hoạt độ của enzyme amylase: Phương pháp Wolhgemuth, Phương pháp Heinkel, Phương pháp Rukhliadeva Geriacheva, Phương pháp Smith và Rose, Phương pháp Gratreva …..
Xác định độ tinh sạch của enzyme: bằng phương pháp điện di
Điện di trên gel Sodium dodecyl sulfate – polyacryamide 10% (SDS PAGE) được thực hiện theo phương pháp của Laemmli (Tipton 1992) trên thiết bị điện di APLELEX với nguồn Electronforesis power supply ST 1006T.
Mẫu chạy điện di phải giữ trong điều kiện -200 – 10C. Các hóa chất điện di được cung cấp bởi hãng Bioad, Mỹ.
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm màu với Coomassie blue G250. Hoạt tính amylase của các vạch isoform được xác định sau khi làm hồi lại hoạt tính theo phương pháp của Lark và Springhorn.
Gel sau khi chạy điện di có thể được chụp ảnh hoặc được sấy bằng cách ngâm trong dung dịch sấy gel và giữ ở giữa hai lớp celophan.
2.9. Sấy
Mục đích
Chế biến: Tạo sản phẩm dạng bột.
Bảo quản: Quá trình sấy làm giảm hàm ẩm, từ đó ức chế vi sinh vật. Những biến đổi trong quá trình sấy
Biến đổi vật lý: Thay đổi khối lượng riêng, tỷ trọng. Biến đổi hóa học: Độ ẩm giảm.
Biến đổi hóa lý: Nước bay hơi, hỗn hợp chuyển sang pha rắn. Thiết bị
Thiết bị sấy phun có đáy hình nón
Ưu điểm:
- Thời gian sấy ngắn.
- Nhiệt độ của vật liệu sấy thấp:
Vì sấy quá nhanh, nhiệt độ của vật liệu trong suốt chu kỳ sấy không vượt quá nhiệt độ của ẩm bốc hơi (60 – 700C) và thấp hơn nhiều so với nhiệt độ của tác nhân sấy.
- Sản phẩm nhận được ở dạng bột nhỏ không cần phải nghiền lại và có độ hòa tan lớn. - Thiết bị có ít khe hở, do đó hạn chế không khí nhiễm bẩn đi qua các khe hở.
Nhược điểm:
- Kích thước của buồng sấy tương đối lớn.
- Cấu tạo thiết bị phức tạp: cơ cấu phun, hệ thống thu hồi bụi và tháo dỡ sản phẩm.