ra ở lợn
2.4.4.1. Phương pháp nghiên cứu bệnh lý, lâm sàng bệnh do giun tròn Trichocephalus
spp. gây ra trên lợn thí nghiệm
* Phương pháp gây nhiễm giun Trichocephalus spp. cho lợn
- Thu nhận trứng giun Trichocephalus spp. có sức gây bệnh: thu thập mẫu phân của những lợn nhiễm giun Trichocephalus spp. ở cường độ nhiễm trên 2000 trứng/gam phân. Sau đó, nuôi trứng giun Trichocephalus spp. phát triển trong phân thành trứng có sức gây bệnh. Thu nhận trứng Trichocephalus spp. có sức gây bệnh bằng phương pháp Darling và tập trung vào 1 cốc thủy tinh chứa 20 ml nước sạch, đảm bảo trong 1 ml có khoảng 2500 trứng (trong khi thu nhận, đếm số trứng trong 1 ml đểđạt được số trứng mong muốn).
- Liều gây nhiễm:
Lợn số 1 cho uống 2 ml, tương đương 5000 trứng giun Trichocephalus spp. Lợn số 2 cho uống 3 ml, tương đương 7500 trứng giun Trichocephalus spp. Lợn số 3 cho uống 4 ml, tương đương 10000 trứng giun Trichocephalus spp. Lợn số 4 cho uống 5 ml, tương đương 12500 trứng giun Trichocephalus spp. Lợn số 5 cho uống 6 ml, tương đương 15000 trứng giun Trichocephalus spp. Ghi ngày bắt đầu gây nhiễm cho lợn để theo dõi.
- Phương pháp bố trí thí nghiệm gây nhiễm: Chọn 10 lợn con 37 ngày tuổi, khỏe mạnh, đều là lợn lai (♂ Yorkshire x ♀ Móng Cái), cùng tính biệt (đều là lợn cái), có khối lượng tương đương. Cả 10 lợn trước khi gây nhiễm được xét nghiệm phân và theo dõi trong 7 ngày để đảm bảo lợn không nhiễm giun
Trichocephalus spp. và không mắc các bệnh khác.
Chia 10 lợn thành 2 lô: lô gây nhiễm 5 con, được gây nhiễm trứng giun
Trichocephalus spp. có sức gây bệnh qua đường miệng; lô đối chứng 5 con: không gây nhiễm trứng giun Trichocephalus spp.
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm trứng giun Trichocephalus spp. cho lợn Lô thí nghiệm TT lợn Tuổi (ngày) Tính biệt Khối lượng (kg) Lợn lai Số lượng trứng giun Trichocephalus spp. gây nhiễm/lợn 1 37 ♀ 8,5 ♂ Yorkshire x ♀ MC 15000 2 37 ♀ 8,3 ♂ Yorkshire x ♀ MC 12500 3 37 ♀ 8,2 ♂ Yorkshire x ♀ MC 10000 4 37 ♀ 8,4 ♂ Yorkshire x ♀ MC 7500 Gây nhiễm 5 37 ♀ 8,2 ♂ Yorkshire x ♀ MC 5000 Đối chứng 5 con 37 ♀ 8,38 ± 0,11 ♂ Yorkshire x ♀ MC 0 Ghi chú: MC - Móng Cái
* Phương pháp theo dõi thời gian hoàn thành vòng đời và diễn biến thải trứng của giun Trichocephalus spp. trên lợn gây nhiễm
- Mỗi lợn sau gây nhiễm được nuôi nhốt riêng trong 1 ô chuồng, 5 lợn đối chứng nhốt chung trong 1 ô chuồng khác; lợn ở hai lô được nuôi trong điều kiện như nhau (điều kiện vệ sinh thú y và chăm sóc nuôi dưỡng tốt).
- Sau 25 ngày gây nhiễm, hàng ngày lấy mẫu phân của 5 lợn gây nhiễm xét nghiệm để theo dõi thời gian hoàn thành vòng đời và diễn biến thải trứng của giun
Trichocephalus spp. trên lợn. Thời gian bắt đầu xuất hiện trứng giun Trichocephalus spp. trong phân lợn gây nhiễm chính là thời gian hoàn thành vòng đời của giun. Cũng xét nghiệm phân lợn đối chứng hàng ngày tương tự như lợn gây nhiễm.
* Phương pháp nghiên cứu bệnh học của lợn gây nhiễm
- Hàng ngày quan sát tỷ mỷ những biểu hiện của lợn gây nhiễm và đối chứng: thể trạng (nhanh nhẹn hay mệt mỏi, ủ rũ), niêm mạc, (màu sắc bình thường hay có những bất thường như sung huyết, xuất huyết, nhợt nhạt...), phân (phân bình thường, sệt hay lỏng), ăn uống (lợn ăn uống tốt hay kém ăn, bỏ ăn), vận động (lợn đi lại bình thường hay ít đi lại, nằm một chỗ...). Theo dõi lợn trong 70 ngày liên tục kể từ khi gây nhiễm trứng giun Trichocephalus spp.. Biểu hiện của lợn ở lô đối chứng cũng được quan sát và ghi chép như trên. Cân từng lợn ở lô gây nhiễm và đối chứng ở các thời điểm 40 ngày, 60 ngày và 70 ngày sau gây nhiễm bằng cùng một cân, cân vào buổi sáng, trước khi cho lợn ăn.
- Xác định một số chỉ tiêu huyết học của lợn gây nhiễm và đối chứng:
Lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn sau khi gây nhiễm 45 và 50 ngày (là thời gian lợn gây nhiễm có biểu hiện lâm sàng rõ nhất) và máu của lợn đối chứng ở cùng thời điểm với lợn gây nhiễm. Mỗi lợn lấy 3 mẫu máu, mỗi mẫu lấy 2 ml máu ở hai ngày khác nhau. Mỗi mẫu máu được đưa vào một tube có chất tráng chống đông máu (heparin). Trên mỗi tube ghi thời gian lấy mẫu, số thứ tự lợn. Mẫu máu được bảo quản trong hộp bảo ôn và được xét nghiệm ngay trong ngày.
Xét nghiệm một số chỉ tiêu huyết học trên máy phân tích huyết học lade tự động Cellta - Mek - 6420k - Nihon Kohden (Nhật Bản). Công thức bạch cầu được xác định bằng phương pháp Tristova.
* Phương pháp xác định bệnh tích đại thể và vi thể
- Xác định bệnh tích đại thể: Mổ khám 5 lợn bị bệnh giun Trichocephalus
spp. sau 70 ngày gây nhiễm để kiểm tra bệnh tích đại thể (quan sát bằng mắt thường và kính lúp các phần của ruột già; đếm số giun Trichocephalus spp. ký sinh ở từng lợn; chụp ảnh vùng có bệnh tích điển hình). Mổ khám 2/5 lợn đối chứng và quan sát để so sánh với lợn gây nhiễm.
- Phương pháp xác định những biến đổi vi thể: Bệnh phẩm sử dụng làm nội dung này là những phần ruột già của lợn gây nhiễm số 1 và số 2, cố định trong dung dịch formol 10%. Nghiên cứu biến đổi vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc Parafin, nhuộm Hematoxillin - Eosin. Mỗi đoạn ruột đúc 4 block, mỗi block chọn 5 tiêu bản cắt mỏng để nhuộm. Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại 150 - 400 lần để kiểm tra những biến đổi vi thể trên tiêu bản nhuộm.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể cụ thể như sau:
+ Lấy mẫu bệnh phẩm (manh tràng và kết tràng lợn): cắt phần bệnh phẩm có nhiều tổn thương.
+ Cốđịnh bệnh phẩm bằng dung dịch formon 10%.
+ Rửa nước 12 - 24 h (rửa dưới dòng nước chảy nhẹ) để trôi hết formol. + Khử nước: dùng cồn tuyệt đối để rút nước từ trong bệnh phẩm ra
+ Làm trong bệnh phẩm: ngâm bệnh phẩm qua hệ thống xylen để làm trong bệnh phẩm
+ Tẩm parafin: ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đựng paraffin nóng chảy, để ở tủấm nhiệt độ 50 oC.
+ Đổ Block: rót parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm parafin vào. Khi parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại Block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: cắt bệnh phẩm trên máy cắt Microtom, độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng 1 phần, glyxerin 1 phần; 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin – Eosin
+ Gắn lamen bằng Baume canada, dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại 150 - 400 lần.