Phương pháp tủa enzyme
Để thu nhận enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để kéo nước ra khỏi protein, giúp protein kết tủa và lắng xuống (Tartsch, B., and Heinzmann, G, 2007). Hiện nay có rất nhiều phương pháp tủa protein được sử dụng mỗi phương pháp đều có những ưu điểm khác nhau. Chúng tôi sử dụng đồng thời ba phương pháp tủa enzyme thông dụng hiện nay đó là tủa băng acetone, muối ammonium sulfase và cồn tuyệt đối. Kết qủa tủa
được trình bày tại hình 3.14.
Dựa vào kết quả hình 3.14, chúng tôi nhận thấy khi tủa bằng các tác nhân khác nhau cho kết quả tủa là khác nhau. Căn cứ vào mức độổn định và khả năng giữđược hoạt tính so với ban đầu là tiêu chí cần thiết khi tủa enzyme nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp tủa bằng acetone để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Hình 3.14. Ảnh hưởng của các dung môi đến khả năng thu nhận enzyme Tinh sạch bằng cách lọc qua Sephadex C-50:
Định lượng protein tổng số và protein sau tinh sạch
Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh coomassie và cả khả năng hấp phụ
ánh sáng ở bước song 595nm, chúng tôi tiến hành định lượng protein trước và sau khi
đi qua cột. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.8:
Bảng 3.8. Kết quảđịnh lượng protein Dịch Tổng lượng Protein (mg) %
Dịch nuôi thô 10368,43 100
Sau khi tủa 495,5 4,78
Sau khi qua cột 118,56 1, 14
Hoạt tính các phân đoạn thu được sau tinh sạch
Sử dụng mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa trong aceton, chúng tôi tra 2ml lên cột sắc ký trao đổi ion. Sau khi rửa cột bằng đệm 20mM Tris-HCl pH 8.0 với thể tích gấp 5 lần thể tích cột, chúng tôi tiến hành thôi protein bằng dung dịch NaCl 1000mM. Các phân đoạn protein thu được đem xác định hoạt độ fucoidnase. Kết quảđược thể hiện trong bảng 3.9:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Bảng 3.9. Hoạt tính fucoidanase của các phân đoạn TT Tên phân đoạn Hoạt tính
fucoidanase (Unit/ml) ± SD Khối lượng (mg)
1 E1 0,48 0,04 20,4 2 E2 0,055 0,045 17,26 3 E3 0,29 0,03 22,3 4 E4 0,44 0,02 11,6 5 E5 0,84 0,04 15,46 6 E6 2,63 0,02 31,54 7 E7 0 0 0 8 E8 0 0 0
Các phân đoạn thu được từ cột được tiến hành xác định hoạt tính fucoidanase theo phương pháp của Miller . Qua số liệu bảng 3.9 cho thấy đã có 10 phân đoạn được thu nhận, trong đó có 6 phân đoạn từ E1 đến E6 có hoạt tính fucoidanase và cao nhất là ở phân đoạn E6 với hoạt tính xác định được là 2,63 unit/ml. So với hoạt tính ban
đầu khi chưa tinh sạch thì hoạt tính ớ phân đoạn này tương đối ổn định điều này chứng tỏ quá trình tinh sạch không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme.
Các phân đoạn sau khi đi qua cột ngoài việc xác định hoạt tính chúng tôi còn tiến hành định lượng theo phương pháp của Bradford . Kết quả trình bày tại bảng 3.9 thì phân đoạn mang hoạt tính fucoidanase cao nhất có khối lượng là lớn nhất đạt 31,54 mg chiếm 26,6% tổng lượng thu được sau khi đi qua cột. Kết quả trên cũng phù hợp với những nghiên cứu trước đó của Wu Qianqian và cộng sự năm 2011 (Wu Qianqian, et al., 2011).
SDS-Page và khối lượng của enzyme fucoidanase
Thực hiện thí nghiệm trên các phân đoạn thu được trong quá trình lọc qua cột và dựa vào chất chuẩn là protein Abumin có khối lượng khoảng 66-69 kDa để xác định khối lượng của fucoidanase cần tìm. Kết quảđược thể hiện tại hình 3.15:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Chú thích