Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường cơ bản với nhiệt độ môi trường thay
đổi từ 27-310C. Kết quả sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy được trình bày ở hình 3.8:
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của fucoidanase phụ thuộc vào tùy từng sinh vật và nguồn phân lập của chúng. Fucoidanase từ một số loài sinh vật biển thể hiện hoạt tính cao ởđiều kiện nhiệt độ nuôi cấy từ 280C – 300C (Qiu, X et al., 2006). Trong khi nhiệt độ tối ưu của động vật thân mền hai mảnh Haliotis là 380C (Tanaka, R et al.,
2004). Từ hình 3.8, chúng tôi nhận thấy khi nuôi cấy chủng vi khuẩn trong các điều
kiện nhiệt độ khác nhau từ 270C – 310C thì hoạt tính fucoidanase có sự thay đổi rõ rệt, cao nhất ở 290C là 2,7 Unit/ml và thấp nhất là ở 310C. Dựa vào hoạt tính enzyme chúng tôi quyết định chọn khoảng nhiệt độ từ 28 đến 300C để thực hiện tối ưu đa hướng để kiểm tra ảnh hưởng đồng thời của nhiều yếu tố.
Đểđánh giá mức độ ảnh hưởng qua lại giữa các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp fucoidanase trên cơ sở tối ưu đơn hướng, chúng tôi tối ưu điều kiện lên men chủng vi khuẩn NV60.36 sinh fucoidanase ở các điều kiện: Nồng độ cơ chất fucoidan; nhiệt
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Bảng 3.7. Ma trận thí nghiệm và các hàm đa biến Nhân tố Nhân tố được mã hóa Đơn vị Mức nghiên cứu -1 0 1 Nồng độ Fucoidan A % 0.01 0.02 0.03 pH B 6 7 8 Nhiệt độ C 0C 28 29 30 Thời gian nuôi cấy D Giờ 24 36 48
Sử dụng phần mền thiết kế thí nghiệm Design Expert 9 và tiến hành loại bỏ các hệ
số hồi quy không phù hợp.Chúng tôi đưa ra được mô hình toán học mô tả quá trình nghiên cứu như sau:
Enzyme = 2.6-0.11*A-0.16*B+0.045*C-0.12*D+0.061*AB+0.077*AC- 0.12*AD+0.032*BC-0.043*BD-0,11*CD-0.23*A2-0.43*B2-0.05*C2-0.33*D2
Tương tác giữa pH và nồng độ cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme
Kết quả khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nồng độ cơ chất fucoidan và pH đến hoạt tính fucoidanase ởđiều kiện cốđịnh nhiệt độ 290C và thời gian nuôi cấy là 36 giờ được trình bày ở hình 3.9.
Hình 3.9. Tương tác giữa pH và nồng độ
cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme
Ở pH cao 8 thì hoạt tính fucoidanase trong vùng nồng độ cơ chất fucoidan ảnh hưởng không đáng kể, không có sự khác biệt. Có sự khác biệt
đáng kể khi điều chỉnh pH vào khoảng 7.5 đến 6.5. Hoạt tính fucoidanase cao hơn khi ở nồng độ cơ chất thấp hơn.
Fucoidan là thành phần chính quy
định độ nhớt của môi trường nên ảnh hưởng đồng thời của pH lớn và nồng độ
cơ chất cao có liên quan tới khả năng trao đổi chất giữa tế bào vi khuẩn với môi trường sống bên ngoài bi hạn chế. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn vi thế mà giảm so với ở nồng độ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Tương tác giữa pH và thời gian tới hoạt tính enzyme
Hình 3.10. Tương tác giữa pH và thời gian tới hoạt tính enzyme
Trong khoảng pH từ 6.5 đến 7 nếu tăng thời gian nuôi cấy lờn hơn 36h thì hoạt tính enzyme sẽ giảm, nếu trong khoảng thời gian từ 30 đến 36 giờ mà thay đổi pH nằm ngoài khoảng 6.5 đến 7 thì hoạt tính enzyme cũng giảm
Tương tác giữa nhiệt độ và nồng độ cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme
Kết quả khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nồng độ cơ chất fucoidan và nhiệt độ đến hoạt tính fucoidanase ởđiều kiện cốđịnh pH và thời gian nuôi cấy được trình bày
ở hình 3.11. Hình 3.11. Tương tác giữa nhiệt độ và nồng độ cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme Ở nồng độ cơ chất fucoidan cao (0.03%) thì hoạt tính fucoidanase trong vùng nhiệt độ được khảo sát không có sự khác biệt, ở nồng độ fucoidan 0.01
đến 0.02% thì nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme fucoidanase, biên độ dao đông nhiệt thích hợp nhất là từ 290C đến 29.50C, vượt ra ngoài khoảng đó thì hoạt tính enzyme sẽ suy giảm (Bùi Minh Lý 2006)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Tương tác giữa thời gian và nồng độ cơ chất fucoidan tới hoạt tính enzyme
Kết quả khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nồng độ cơ chất fucoidan và thời gian đến hoạt tính fucoidanase ởđiều kiện cốđịnh pH và nhiệt độ nuôi cấy được trình bày ở hình 3.12:
Hình 3.12. Tương tác giữa thời gian và nồng độ cơ chất fucoidan tới fucoidanase
Nồng độ cơ chất và thời gian nuôi cấy có sự tương tác qua lại và ảnh hưởng
đồng thời đến hoạt tính fucoidanase, kết quảđược trình bày ở hình 3.12. Khi nuôi cấy chủng NV60.36 trong điều kiện pH7, nhiệt độ 280C thì hoạt tính enzyme phụ thuộc rất lớn đến thời gian nuôi cấy.
Đường kính các vòng tối ưu càng nhỏ
thì mức độ tương tác giữa các yếu tốđến hoạt tính fucoidanase càng lớn.
Ở nồng độ cơ chất lớn hơn 0,03% thì hoạt tính fucoidanase không có sự thay
đổi đáng kể ở các khoảng thời gian khảo sát, ở nồng độ cơ chất từ 0,01% đến 0,03% thì thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất enzyme. Khoảng thời gian tối ưu là từ 30 đến 36 giờ, ngoài khoảng tối ưu trên thì hoạt tính fucoidanase sẽ suy giảm.
Dựa vào phần mềm tối ưu Design Expert 9, nhằm đạt được hiệu suất enzyme fucoidanase cao nhất, chúng tôi đã chọn được giải pháp:
Thành phần môi trường: 5g pepton, 2g Cao nấm men, 0.05g MgSO4.7H2O, 0.2g K2HSO4, pH = 6,9, 500ml nước biển, 500ml nước cất với thời gian 36 giờ, vòng lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 290C và nồng độ fucoidan 0,02%.
So sánh hoạt tính fucoidanase của chủng NV60.36 trên môi trường lên men tối
ưu và chưa tối ưu.
Nuôi cấy đồng thời chủng vi khuẩn NV60.36 trên môi trương tối ưu và trên môi trường cơ bản, hoạt tính fucoidanase có sự khác biệt và được trình bày ở hình 3.13:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Hình 3.13. Hoạt tính fucoidanase trong môi trường cơ bản và tối ưu
Sử dụng môi trường tối ưu trên tiến hành lên men chủng vi khuẩn NV60.36 để đánh giá hiệu qủa tổng hợp fucoidanase so với môi trường vơ bản. Chúng tôi nhận thấy với hoạt tính đạt 2,71 unit/ml so với hoạt tính ban đầu là 2,43 unit/ml Với giải pháp trên hiệu xuất enzyme đạt 12% so với ban đầu.