- Phân tích số liệu và xử lý thống kê các số liệu thu thập được bằng phép thử ANOVA (General Linear Model) của phần mềm Minitab version 16.
26
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Triệu chứng biểu hiện trên chuột thí nghiệm
Triệu chứng biểu hiện trên chuột sau khi tiêm E. coli ở tất cả các nghiệm thức: - Sau 15 phút: chuột đi lại chậm chạp, ủ rũ, mệt mỏi, giảm hoạt động. - Sau 30 phút: 50% số chuột tiêu chảy, bắt đầu giảm thân nhiệt. - Sau 60 phút: 100% chuột tiêu chảy, co rúm lại.
- Sau 60 phút: cho chuột uống cao.
- Sau 2 giờ: mắt chuột xuất huyết nhẹ, hơi ướt, 2 mí mắt gần dính nhau. - Sau 4 giờ: chuột có vẻ ốm lại do tiêu chảy và chúng không ăn uống được. - Sau 6 giờ: chuột ở lô đối chứng bắt đầu chết.
- Sau 12 giờ: chuột ở NT1 bắt đầu chết, số còn lại vẫn tiêu chảy, mệt mỏi. - Sau 24 giờ: số chuột chết giảm đi, chuột vẫn còn tiêu chảy nhưng phân sệt hơn, chuột bắt đầu ăn uống trở lại.
- Sau 3 ngày: một số chuột hết tiêu chảy, thân nhiệt tăng trở lại bình thường nhưng thân nhiệt chuột ở lô đối chứng vẫn còn thấp, chuột hoạt động trở lại.
- Sau 4 ngày: hơn một nửa số chuột còn sống hết tiêu chảy, ăn uống và hoạt động bình thường.
- Sau 5 ngày: chuột hết tiêu chảy hoàn toàn và khỏe mạnh trở lại.
Sau đây là tỷ lệ biểu hiện các triệu chứng trong quá trình thí nghiệm được trình bày qua bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tần suất triệu chứng biểu hiện trên chuột thí nghiệm (n=12)
Loại triệu chứng NT1 NT2 NT3 ĐC
n % n % n % n %
Ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn Tiêu chảy
Giảm thân nhiệt
Xuất huyết mí mắt, mắt híp lại Bại liệt 2 chân sau
Triệu chứng thần kinh 12 12 12 5 0 0 100 100 100 41,7 0 0 12 12 12 5 1 0 100 100 100 41,7 8,3 0 12 12 12 4 0 0 100 100 100 33,3 0 0 12 12 12 6 1 1 100 100 100 50 8,3 8,3 Chú thích: n: số lượng chuột.
Qua bảng 4.1 cho thấy các triệu chứng trên chuột khi bị nhiễm E. coli.
Triệu chứng lâm sàng có tần suất xuất hiện cao nhất ở cả lô đối chứng và lô điều trị là tiêu chảy và triệu chứng mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn (100%), kết quả này phù hợp với Yousif et al. (2013) kết luận chuột nhiễm E. coli thường tiêu chảy, chán ăn,
27 mất nước, ủ rũ, nhịp hô hấp tăng.
Kế đến là triệu chứng thân nhiệt giảm với tỷ lệ 100%, tiếp theo là triệu chứng xuất huyết mí mắt, mắt híp lại ở lô đối chứng là 50%, còn ở các nghiệm thức điều trị thì thấp hơn, cụ thể NT1, NT2 là 41,7%, NT3 là 33,3%.
Tiếp theo là triệu chứng bại liệt 2 chân sau với 8,3% ở lô đối chứng và NT2, các nghiệm thức còn lại không xuất hiện triệu chứng này.
Cuối cùng là triệu chứng thần kinh xuất hiện với tần suất thấp nhất, 8,3% ở lô đối chứng và không xuất hiện (0%) ở các nghiệm thức điều trị. Một số triệu chứng có tần suất bằng nhau ở cả hai lô đối chứng và điều trị, còn lại một số triệu chứng ở lô điều trị thì xuất hiện với tần số thấp hơn lô đối chứng. Điều này cho thấy cao Cỏ lào có tác dụng trong điều trị E. coli.
Hình 13: Chuột bị tiêu chảy
28
4.2. Trọng lượng trung bình của chuột trước và sau thí nghiệm
Bảng 4.2: Trọng lượng trung bình chuột trước và sau thí nghiệm
Nghiệm thức Trọng lượng trung bình trước thí nghiệm (g) Trọng lượng trung bình sau thí nghiệm (g) Chênh lệch (g)
NT1 23,58 23,17 -0,41
NT2 23,81 23,55 -0,26
NT3 24,36 24,39 +0,03
ĐC 23,51 23,19 -0,32
Chú thích: - :giảm; + : tăng
Qua bảng 4.2 cho ta thấy trọng lượng trung bình của chuột trước thí nghiệm và sau thí nghiệm hầu như không thay đổi, ở một số nghiệm thức thì giảm nhẹ và cũng tăng nhẹ ở một số nghiệm thức khác, nhưng trọng lượng chỉ thay đổi rất nhỏ. Ở NT1 trọng lượng chuột trung bình sau thí nghiệm giảm 0,41 g so với trước thí nghiệm. Ở NT2 trọng lượng chuột cũng giảm 0,26 g. Riêng NT3 thì trọng lượng chuột tăng 0,03g. Cuối cùng là lô đối chứng giảm 0,32 g so với trước thí nghiệm. Chuột giảm trọng lượng là do tiêu chảy, không ăn uống nên trọng lượng giảm nhanh, sau đó chúng khỏe hơn và ăn uống trở lại.
4.3. Tỷ lệ chuột sống sau khi dùng cao Cỏ lào điều trị
Sau khi điều trị, số chuột còn sống và khỏi bệnh được tổng kết và trình bày qua bảng 4.3.
Bảng 4.3: Tỷ lệ chuột sống sau khi điều trị (%) (N=12)
Chỉ tiêu ĐC NT1 NT2 NT3 n % n % n % n % Tỷ lệ chuột sống Sau 1 ngày 6 50,0b 7 58,3b 9 75ab 11 91,7a Sau 2 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 3 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 4 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 5 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 6 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 7 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Tỷ lệ khỏi bệnh 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a
Trị số trên cùng hàng có số mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) - n: số lượng chuột sống.
- N: tổng số lượng chuột.
Ở nghiệm thức đối chứng, không cho chuột uống cao Cỏ lào, tỷ lệ chuột còn sống sau 7 ngày theo dõi là 41,7% (tỷ lệ sống dưới 50%). Ở nghiệm thức thứ 1, cho chuột uống cao với liều 0,5 g/kgP thì tỷ lệ chuột sống sau 7 ngày điều trị là 41,7% (tỷ lệ sống dưới 50%). Đối với nghiệm thức thứ 2, chuột uống cao với liều 1,0 g/kgP thì tỷ lệ chuột khỏi bệnh sau 7 ngày điều trị là 75% (tỷ lệ khỏi bệnh trên 50%). Cuối cùng là nghiệm thức thứ 3, cho chuột uống cao với liều 1,5 g/kgP thì tỷ
29 lệ chuột khỏi bệnh sau điều trị đến 83,3%.
Qua bảng 4.3 cho thấy cao Cỏ lào có tác dụng tốt trong điều trị chuột bị nhiễm E. coli. Trong đó NT3 có hiệu quả điều trị cao nhất (83,3%), kế đến là NT2 (75%), cuối cùng là NT1 hiệu quả điều trị không cao (41,7%), kết quả này tương đương với nghiệm thức đối chứng (41,7%). Tuy nhiên, ở NT1 chuột chết chậm hơn so với đối chứng do cao Cỏ lào có thể kiềm hãm nhẹ được vi khuẩn E. coli. Sự khác nhau về hiệu quả điều trị giữa các nghiệm thức là do khác nhau về nồng độ cao Cỏ lào cho chuột uống. NT3 có hiệu quả cao nhất do chuột uống liều cao (1,5 g/kgP), do đó cao đủ khả năng khống chế được vi khuẩn. Còn NT1, chuột được uống cao với nồng độ thấp (0,5 g/kgP) nên không đủ ức chế vi khuẩn, vì thế hiệu quả điều trị thấp. Các nghiệm thức khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Số liệu trên cũng đồng thời nói lên khi gây nhiễm E. coli, chuột chết trong 2 ngày đầu, sau ngày thứ 3 tỷ lệ này không thay đổi và giữ nguyên đến ngày thứ 7. Điều đó cho thấy nếu những chuột còn sống sau 2 ngày tiêm E. coli thì chuột sẽ
không chết và từ từ hồi phục. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Picard et al. (1999) cho rằng chuột bị nhiễm E. coli thường chết trong 18 giờ sau khi tiêm hoặc chết trong thời gian từ 1-3 ngày sau khi tiêm. Nếu chuột còn sống sau hơn 7 ngày là coi như sống sót lâu dài (Yousif et al., 2013).
4.4. Bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm
Sau 7 ngày điều trị tất cả chuột thí nghiệm đều được mổ khám. Bệnh tích đại thể của chuột khi mổ được thể hiện qua bảng 4.4.
Bảng 4.4: Tần suất xuất hiện bệnh tích trên chuột (N=28)
Loại bệnh tích
Số lượng (n) và tỷ lệ (%) chuột biểu hiện bệnh tích Trung bình NT ĐT (%) NT1 NT2 NT3 ĐC n % n % n % n % Lách to hơn 3 60 4 50 4 40 3 60 50
Dạ dày teo hoặc mỏng hơn 3 60 3 37,5 4 40 4 80 45,8
Thận bị hoại tử 2 40 2 25 2 20 2 40 28,3
Ruột (đặc biệt là manh tràng) chướng hơi và thành ruột rất mỏng.
2 40 2 25 1 10 3 60 25
Gan bị xuất huyết điểm 1 20 1 12,5 1 10 1 20 14,2
Chú thích: n: số lượng chuột thể hiện bệnh tích.
N: tổng chuột sống, trong đó NT1: 5; NT2: 5; NT3: 8; NT ĐC: 10 Tỷ lệ (%)=số lượng chuột thể hiện bệnh tích/số chuột sống ở mỗi NT.
Bệnh tích xuất hiện chủ yếu ở ruột, dạ dày, lách gan và thận, không ghi nhận được bệnh tích ở phổi và tim. Bệnh tích trung bình ở NT điều trị chiếm tỷ lệ cao nhất là lách to hơn bình thường (50%), trong đó NT3 chiếm tỷ lệ thấp nhất (40%); dạ dày teo hoặc mỏng hơn (45,8%), trong đó NT2 và NT3 chiếm tỷ lệ thấp (40%);
30
kế đến là thận bị hoại tử (28,3%), trong đó NT3 chiếm tỷ lệ thấp nhất (20%); ruột bị chướng hơi, thành ruột mỏng (25%), trong đó NT3 chiếm tỷ lệ thấp nhất (10%). Bệnh tích này phù hợp với kết quả của Krystle (2011) kết luận chuột bị nhiễm E. coli tập trung chủ yếu suốt đoạn ruột già và ruột non gây viêm đại tràng. Bên cạnh
đó bệnh tích này cũng giống với kết luận của Adruew et al. (1972) tiêm E. coli vào dạ dày chuột sơ sinh thì ruột non phình ra chứa một chất lỏng trong suốt (sau 4 giờ tiêm). Cuối cùng là gan bị xuất huyết là bệnh tích có tần suất thấp (14,2%), trong đó NT3 chiếm tỷ lệ thấp nhất (10%). Kết quả này cho thấy sau khi điều trị, một số chuột không chết nhưng thể hiện bệnh ở dạng mãn tính hoặc dần dần phục hồi. Khi so sánh hiệu quả điều trị giữa các nghiệm thức thấy rằng ở NT3 (1,5 g/kgP) có hiệu quả điều trị cao nhất.
Kết quả mổ khám cho thấy bệnh tích ở các NT điều trị xuất hiện với tần suất thấp hơn so với NT đối chứng, trong đó NT3 có phần giảm đáng kể nhất. Điều này cho thấy cao Cỏ lào có tác dụng tốt trên chuột điều trị đặc biệt là đối với liều dùng 1,5 g/kgP, mặc dù chuột không hết bệnh hoàn toàn nhưng với kết quả trên đã chứng tỏ cao Cỏ lào cũng làm giảm các bệnh tích trong nội tạng.
Sau đây là một số hình ảnh về bệnh tích của chuột thí nghiệm sau điều trị và đối chứng.
Hình 15 : Lách chuột
31
Hình 15 cho thấy lách chuột bị nhiễm E. coli lớn hơn lách đã điều trị nhiều
lần.
Hình 16 là hình ảnh thận điều trị đã bình thường trong khi thận bị nhiễm E.
coli ở lô đối chứng bị tích nước, nhạt màu. Điều này cho thấy thận tích nước, nhạt
màu không phải do tác động của cao cỏ lào mà do E. coli.
Hình 17: Dạ dày chuột
Hình 17 cho thấy dạ dày chuột bị nhiễm E. coli bị teo nhỏ và ở lô điều trị to hơn nhưng vẫn nhỏ hơn so với dạ dày bình thường. Điều này chứng tỏ dạ dày bị teo là bệnh tích biểu hiện với tần suất lớn xảy ra ở cả lô đối chứng và lô điều trị do độc tố vi khuẩn tác động lên dạ dày.
Hình 18: Manh tràng chuột
Hình 18 là manh tràng của chuột đã điều trị bằng cao Cỏ lào và chuột bị nhiễm
E. coli, chuột bị nhiễm bệnh thì manh tràng thường chứa nhiều hơi và biểu mô ruột
rất mỏng. Kết quả này cũng gần giống với Ayman Mariri (2008) cho rằng E. coli
32
Hình 19: Gan chuột bị xuất huyết do bị nhiễm E. coli và gan chuột giảm xuất huyết sau điều trị so với gan bình thường
4.5. Kết quả tái phân lập vi khuẩn
Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ mẫu bệnh phẩm ruột, dạ dày, gan, thận và phân chuột chết cho thấy: khi cấy bệnh phẩm lên môi trường TBX có sự hiện diện của vi khuẩn E. coli với hình dạng khuẩn lạc tròn, bóng, lồi, màu xanh trên môi trường đặc trưng TBX. Kết quả này tương tự nghiên cứu của Lê Thị Hoài (2008) khi phân lập các bệnh phẩm gan, lách, ruột ở heo tiêu chảy đều thấy sự xuất hiện của vi khuẩn E. coli với tỉ lệ là 100%. Quan sát các đĩa nuôi cấy, nhận thấy khuẩn lạc E. coli có số lượng tương đối nhiều và chủ yếu ở bệnh phẩm ruột và phân. Các mẫu bệnh phẩm còn lại đều có khoảng mười khuẩn lạc. Như vậy xác định chuột chết là do độc lực của vi khuẩn E. coli.
Hình 20: Khuẩn lạc E. coli được phân lập từ phân, ruột chuột trên môi trường TBX
33
4.6. Bệnh tích vi thể một số cơ quan chuột sau thí nghiệm
Sau 7 ngày điều trị chúng tôi tiến hành mổ khám số chuột khỏi bệnh, lấy gan, thận, dạ dày, ruột của chuột làm tiêu bản vi thể để kiểm tra tác động của cao lên gan, thận, và sự biến đổi biểu mô dạ dày, ruột trong quá trình điều trị.
Hình 21: Mô thận (lô điều trị) dưới kính hiển vi (100X)
Hình 22: Mô thận bị hoại tử (lô đối chứng) dưới kính hiển vi (40X)
Hình 21 và hình 22 là mô thận dưới kính hiển vi. Với hình 21 là hình thận không bị hoại tử, gần như bình thường được lấy ở lô điều trị, trên thận có sự sung huyết nhẹ, đây có thể là sung huyết do phương pháp giết chuột lúc mổ khám, chuột được gây mê bằng chloroform nên máu vẫn ứ lại trong cơ thể. Hình 22 là hình thận bị hoại tử, chứa nhiều mủ đặc. Bệnh tích này có thể là do vi khuẩn gây ra vì chuột ở lô điều trị và lô đối chứng đều có thận bị hoại tử.
Vi cầu thận
Chỗ xuất huyết
Vi cầu thận
34
Hình 23: Mô gan chuột (lô điều trị) dưới kính hiển vi (40X)
Hình 23 thể hiện các mô gan của chuột ở lô điều trị. Mô gan gần như bình thường ngoài những chỗ sung huyết. Hiện tượng sung huyết này cũng do phương pháp giết chuột bằng thuốc mê chloroform nên máu còn ứ lại trong cơ thể. Gan chuột bình thường chứng tỏ cao không có tác động xấu lên gan và an toàn cho chuột được điều trị.
Hình 24: Mô dạ dày (lô điều trị) chuột dưới kính hiển vi (40X)
Hình 24 cho thấy mô dạ dày chuột dưới kính hiển vi được lấy ở lô điều trị. Mặc dù dạ dày chuột bị teo và biến dạng nhưng cấu trúc mô vẫn không thay đổi nhiều, nhìn gần giống như mô dạ dày bình thường.
Chỗ sung huyết
Lớp cơ Lớp biểu mô
35
Hình 25: Mô manh tràng (lô điều trị) dưới kính hiển vi (40X)
Hình 25 là mô manh tràng của chuột dưới kính hiển vi, mẫu được lấy từ manh tràng của chuột bị chướng hơi. Hình ảnh cho thấy lớp biểu mô của manh tràng rất ngắn do thành manh tràng bị bào mòn. Ở ruột bình thường thì lớp cơ rất mỏng so với lớp biểu mô, còn ở mô manh tràng này thì lớp cơ và lớp biểu mô gần như bằng nhau. Kết quả này phù hợp với bệnh tích đại thể (ruột bị chướng hơi với thành ruột rất mỏng) và cũng là bệnh tích đặc trưng của nhiễm E. coli.
Tóm lại, qua các bệnh tích đại thể và vi thể của chuột thí nghiệm sau điều trị ta có thể kết luận: cao Cỏ lào làm giảm tác hại của E. coli và không ảnh hưởng đến
gan, thận, không gây độc cho chuột điều trị. Kết quả này phù hợp với Nghiêm Tuấn Hải (2005) cho rằng Cỏ lào có độc tính rất thấp khi dùng đường uống, liều LD50 trên chuột nhắt: thân 160 g/kg thể trọng, lá 135 g/kg thể trọng, rễ 120 g/kg thể trọng. Trong thực tế nhiều tác giả và dân gian đã dùng liều khá cao từ 30-50 g lá tươi/ngày trong 7 ngày mà không có biểu hiện nhiễm độc. Bên cạnh đó, cao Cỏ lào có tác dụng giúp cơ thể chuột nhanh hồi phục và làm giảm các tần suất xuất hiện triệu chứng (Nghiêm Tuấn Hải, 2005).
Cao Cỏ lào có tác dụng điều trị bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra nhờ vào các thành phần hóa học chính là tanin, tinh dầu và flavonoid có chứa các hoạt chất kháng sinh. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ngô Quốc Luân và Nguyễn Ngọc Hạnh (2006) tinh dầu Cỏ lào và các flavonoid (odoratin, ombutin, 5,7-dihydroxy-4-methoxyflavanone, 3,5,7-trihydroxy-4-methoxyflavone, 4,2’- dihydroxy-4’,5’,6’-trimethoxychalcone) có khả năng kháng một số loại vi khuẩn gram âm, gram dương, nấm men, nấm mốc. Cũng như Dieneba Bamba et al. (1993) đã chứng minh thành phần tinh dầu Cỏ lào có khoảng 38 hợp chất (trong đó có 26