3.3.1. Nguyên liệu
Lá cây Cỏ lào của dòng có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất theo Nguyễn Thị Hồng Diễm (2014) được lấy từ Cần Thơ, Hậu Giang, Sóc Trăng.
Chủng E. coli K88 được phân lập từ thực địa, phòng Vi sinh, bộ môn Thú y,
khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ.
Động vật thí nghiệm: chuột bạch (Mus musculus domesticus) giống ddY (Nhật Bản) sạch bệnh, có trọng lượng từ 18-22 g (từ 4-6 tuần tuổi) có nguồn gốc từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, máy lọc chân không, máy cô quay chân không,
Autoclave, máy quang phổ.
Dụng cụ: cân điện tử, bình nón, phễu, đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, chai
nấu môi trường, ống Mac Farland.
Hóa chất: methanol, dung môi DMSO, nước cất, môi trường MHA, môi
trường TBX, môi trường NA, môi trường NB, formol, cồn.
20
3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Cách thu mẫu 3.4.1. Cách thu mẫu
Lá Cỏ lào (ngọn và lá cây trưởng thành có chiều cao khoảng 1,0-1,5 m, chưa có hoa, không hái những lá già hoặc bị sâu) được thu hái vào buổi sáng (khoảng 8- 10 giờ), trọng lượng 1 kg.
3.4.2 Cách chiết xuất cao thô
Lá Cỏ lào được rửa sạch, loại bỏ phần bị sâu, nấm ký sinh và những tạp chất khác (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985), sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50oC đến khi trọng lượng không đổi và đem nghiền mịn. Ngâm lá Cỏ lào nghiền mịn trong methanol (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1) 3 ngày, sau đó chiết lấy dịch chiết và tiếp tục ngâm và chiết với methanol lần 2 (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1), chiết lần 3 (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1) (24 giờ/lần). Loại bỏ dung môi trong các dịch chiết bằng cách cô đặc các dịch chiết bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC cho đến “cắn”, thu được cao sử dụng trong thí nghiệm (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985).
Ghi chú: “cắn” là cao bám vào thành bình cô quay khô cho đến khi nứt nẻ.
Hình 6: Nguyên liệu tươi Hình 7: Nguyên liệu khô
21
Hình 10: Qui trình chiết xuất cao (Nguyễn Văn Đànvà Nguyễn Viết Tựu, 1985)
-Cô quay ở 40oC Dịch chiết
(lần 1, trữ)
Mẫu lá đã lấy dịch chiết (lần 1)
Dịch chiết (lần 2, trữ)
Mẫu đã lấy dịch chiết (lần 2)
Dịch chiết (lần 3, trữ)
Mẫu đã lấy dịch chiết (lần 3)
- Ngâm 3 ngày - Lọc
Cao thô Loại bỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu tươi
-Sấy 50oC -Nghiền mịn Mẫu sấy + methanol (lần 1)
- Ngâm methanol (24 giờ) - Lọc
- Ngâm methanol (24 giờ) - Lọc
22
Trước Sau
Hình 11: Cao Cỏ lào trước và sau khi pha DMSO
3.4.3. Nuôi chuột
Chuột bạch được mua từ viện Pasteur từ 4-6 tuần tuổi, có trọng lượng từ 18- 22 g, nuôi trong các hộp nhựa hình chữ nhật có kích thước 30x15x10 cm, phía trên có nắp đậy. Mỗi ô hộp được lót bằng trấu, có thức ăn và nước uống riêng. Nước uống là nước cất được đựng trong chai nhựa có nắp đậy và có ống thông nhỏ cắm vào nắp chuồng. Chuột nuôi được cho ăn với khẩu phần khoảng 5 g/ngày, mỗi ngày cho ăn 2 lần với thức ăn viên dành riêng cho chuột, đồng thời bổ sung thêm các loại rau củ như dưa leo, giá, khoai lang. Mỗi ngày sẽ dọn vệ sinh một lần vào buổi sáng đồng thời thay trấu và nước. Tất cả chuột thí nghiệm được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng điều kiện.
3.4.4. Phương pháp chuẩn bị canh khuẩn để tiêm truyền
Được mô tả theo Picard et al. (1999), vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường NA ở 37oC trong 24 giờ sau đó được chuyển qua môi trường NB (pH=7,3) để nuôi tăng sinh trong 4 giờ, trong quá trình nuôi cấy có lắc kích thích tăng sinh vi khuẩn. Lấy dung dịch trên đem ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút, phần dung dịch nổi bên trên sau khi ly tâm được loại bỏ, phần lắng dưới đáy được rửa sạch 2 lần với dung dịch Ringer’s Solution và pha loãng với dung dịch Ringer’s Solution để có được nồng độ 1010 CFU/ml (dựa vào dung dịch chuẩn Mac Farland 0,5 và kiểm tra lại mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 600 nm, điều chỉnh OD-1±0,1). Dung dịch này sử dụng làm canh khuẩn để tiêm truyền cho chuột bạch.
23
3. 4.5. Bố trí thí nghiệm
Hình 12: Bố trí thí nghiệm
Chuột mua về nuôi thích nghi 1 tuần thì bắt đầu thí nghiệm điều trị. Bố trí thí nghiệm được trình bày qua bảng 3.1.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm tiêm vi khuẩn và dùng cao Cỏ lào điều trị E. coli trên chuột
NT Số
chuột Tiêm (ml/con) E. coli
Nguồn tác động Đường cấp thuốc Liều uống (ml) Liều dùng (g/kgP) Lần điều trị (lần/ngày)
NT1 12 1,0 Cao Cỏ lào Uống 0,1 0,5 2
NT2 12 1,0 Cao Cỏ lào Uống 0,1 1,0 2
NT3 12 1,0 Cao Cỏ lào Uống 0,1 1,5 2
ĐC 12 1,0 DMSO pha
nước Uống 0,1 - 2
Ghi chú: NT (Nghiệm thức), ĐC (Đối chứng), P (Trọng lượng)
Từ kết quả thử LD50 (3,16x109 CFU/ml) và kết quả MIC cao Cỏ lào trên E. coli của Nguyễn Thị Hồng Diễm (2014). Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên gồm 4 nghiệm thức: 3 nghiệm thức điều trị (NT1, NT2, NT3) và nghiệm thức đối chứng (ĐC). Mỗi nghiệm thức 4 chuột với 3 lần lặp lại, tổng số chuột dùng trong thí nghiệm là 48 con. Tất cả các chuột đều được gây nhiễm với vi khuẩn
E.coli nồng độ 3,16x109 CFU/ml, liều 1,0 ml/con bằng đường tiêm xoang bụng. Dùng 3 liều cao khác nhau để điều trị và theo dõi những biểu hiện lâm sàng liên tục trong 7 ngày. Đối với lô đối chứng, nguồn tác động là DMSO 10% pha với nước (lượng DMSO pha với nước sẽ bằng với lượng DMSO dùng để hòa tan Cỏ lào). Chuột ở các nghiệm thức điều trị 60 phút sau khi tiêm vi khuẩn bắt đầu cho uống cao Cỏ lào: NT1 với liều 0,5 g/kg thể trọng, NT2 liều 1,0 g/kg thể trọng, NT3 liều 1,5 g/kg thể trọng. Nghiệm thức đối chứng cho chuột uống DMSO pha nước sinh lý với liều 0,1 ml/con.
24
Cách pha cao cho chuột uống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cao được pha với một lượng vừa đủ dung dịch DMSO (10%) để cao có thể hòa tan hết, sau đó cho dung dịch cao vừa pha vào nước cất (tỷ lệ 1:5) để đảm bảo nồng độ cao trên mỗi chuột như đã quy định trên mỗi nghiệm thức.
Dựa vào công thức: C1 x V1=C2 x V2 (Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm (CLSI), 2011). Trong đó:
C1: nồng độ dung dịch gốc C2: nồng độ dung dịch cần pha
V1: thể tích cần tính để tạo nồng độ dung dịch cần pha V2: thể tích dung dịch cần pha
Cân 800 mg cao cho vào 10ml dung môi DMSO 10% tiệt trùng, được dung dịch gốc có nồng độ C1:80000 µg/ml. Nồng độ ức chế vi khuẩn cần pha C2:2048 µg/ml, V2:20 ml.
Như vậy: V1=(2048 x 20)/80000= 0,512 ml hay tương đương 0,5 g cao Cỏ lào.
Sau đó ta cứ tăng liều NT2 gấp 2 lần NT1 và NT3 gấp 3 lần NT1 để thử nghiệm hiệu quả.
Dung dịch được pha mỗi ngày vào buổi sáng và cho chuột uống bằng micropipette 0,1 ml. Dung dịch cao được khuấy đều trước khi cho uống.
Đối với lô đối chứng cho chuột uống liều: 0,1ml/chuột bằng DMSO (10%) + nước cất theo tỷ lệ 1:5.
3.4.6. Chỉ tiêu theo dõi
- Biểu hiện lâm sàng tất cả các chuột thí nghiệm. - Bệnh tích trên chuột sau khi điều trị bằng cao Cỏ lào. - Trọng lượng chuột.
- Tỉ lệ chuột sống = (số con sống/tổng số con thí nghiệm) x 100 - Tỉ lệ chuột chết = (số con chết/tổng số con thí nghiệm) x 100 - Tỉ lệ khỏi bệnh = (số con khỏi bệnh/số con điều trị) x 100
3.4.7. Cách làm tiêu bản vi thể ở các cơ quan nội tạng trên chuột
Số chuột khỏi bệnh sau thí nghiệm được mổ khám để lấy các cơ quan: gan, thận, dạ dày, ruột cho vào chai nhựa chứa formol 10% để bảo quản mẫu, các nghiệm thức được chứa riêng ở mỗi chai, sau đó gửi đến trường Đại học Y Dược làm tiêu bản vi thể nhằm kiểm tra tác động của cao lên gan, thận ở mức độ vi thể và sự biến đổi biểu mô ruột và dạ dày sau thí nghiệm.
25
3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
- Phân tích số liệu và xử lý thống kê các số liệu thu thập được bằng phép thử ANOVA (General Linear Model) của phần mềm Minitab version 16.
26
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Triệu chứng biểu hiện trên chuột thí nghiệm
Triệu chứng biểu hiện trên chuột sau khi tiêm E. coli ở tất cả các nghiệm thức: - Sau 15 phút: chuột đi lại chậm chạp, ủ rũ, mệt mỏi, giảm hoạt động. - Sau 30 phút: 50% số chuột tiêu chảy, bắt đầu giảm thân nhiệt. - Sau 60 phút: 100% chuột tiêu chảy, co rúm lại.
- Sau 60 phút: cho chuột uống cao.
- Sau 2 giờ: mắt chuột xuất huyết nhẹ, hơi ướt, 2 mí mắt gần dính nhau. - Sau 4 giờ: chuột có vẻ ốm lại do tiêu chảy và chúng không ăn uống được. - Sau 6 giờ: chuột ở lô đối chứng bắt đầu chết.
- Sau 12 giờ: chuột ở NT1 bắt đầu chết, số còn lại vẫn tiêu chảy, mệt mỏi. - Sau 24 giờ: số chuột chết giảm đi, chuột vẫn còn tiêu chảy nhưng phân sệt hơn, chuột bắt đầu ăn uống trở lại.
- Sau 3 ngày: một số chuột hết tiêu chảy, thân nhiệt tăng trở lại bình thường nhưng thân nhiệt chuột ở lô đối chứng vẫn còn thấp, chuột hoạt động trở lại.
- Sau 4 ngày: hơn một nửa số chuột còn sống hết tiêu chảy, ăn uống và hoạt động bình thường.
- Sau 5 ngày: chuột hết tiêu chảy hoàn toàn và khỏe mạnh trở lại.
Sau đây là tỷ lệ biểu hiện các triệu chứng trong quá trình thí nghiệm được trình bày qua bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tần suất triệu chứng biểu hiện trên chuột thí nghiệm (n=12)
Loại triệu chứng NT1 NT2 NT3 ĐC
n % n % n % n % (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn Tiêu chảy
Giảm thân nhiệt
Xuất huyết mí mắt, mắt híp lại Bại liệt 2 chân sau
Triệu chứng thần kinh 12 12 12 5 0 0 100 100 100 41,7 0 0 12 12 12 5 1 0 100 100 100 41,7 8,3 0 12 12 12 4 0 0 100 100 100 33,3 0 0 12 12 12 6 1 1 100 100 100 50 8,3 8,3 Chú thích: n: số lượng chuột.
Qua bảng 4.1 cho thấy các triệu chứng trên chuột khi bị nhiễm E. coli.
Triệu chứng lâm sàng có tần suất xuất hiện cao nhất ở cả lô đối chứng và lô điều trị là tiêu chảy và triệu chứng mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn (100%), kết quả này phù hợp với Yousif et al. (2013) kết luận chuột nhiễm E. coli thường tiêu chảy, chán ăn,
27 mất nước, ủ rũ, nhịp hô hấp tăng.
Kế đến là triệu chứng thân nhiệt giảm với tỷ lệ 100%, tiếp theo là triệu chứng xuất huyết mí mắt, mắt híp lại ở lô đối chứng là 50%, còn ở các nghiệm thức điều trị thì thấp hơn, cụ thể NT1, NT2 là 41,7%, NT3 là 33,3%.
Tiếp theo là triệu chứng bại liệt 2 chân sau với 8,3% ở lô đối chứng và NT2, các nghiệm thức còn lại không xuất hiện triệu chứng này.
Cuối cùng là triệu chứng thần kinh xuất hiện với tần suất thấp nhất, 8,3% ở lô đối chứng và không xuất hiện (0%) ở các nghiệm thức điều trị. Một số triệu chứng có tần suất bằng nhau ở cả hai lô đối chứng và điều trị, còn lại một số triệu chứng ở lô điều trị thì xuất hiện với tần số thấp hơn lô đối chứng. Điều này cho thấy cao Cỏ lào có tác dụng trong điều trị E. coli.
Hình 13: Chuột bị tiêu chảy
28
4.2. Trọng lượng trung bình của chuột trước và sau thí nghiệm
Bảng 4.2: Trọng lượng trung bình chuột trước và sau thí nghiệm
Nghiệm thức Trọng lượng trung bình trước thí nghiệm (g) Trọng lượng trung bình sau thí nghiệm (g) Chênh lệch (g)
NT1 23,58 23,17 -0,41
NT2 23,81 23,55 -0,26
NT3 24,36 24,39 +0,03
ĐC 23,51 23,19 -0,32
Chú thích: - :giảm; + : tăng
Qua bảng 4.2 cho ta thấy trọng lượng trung bình của chuột trước thí nghiệm và sau thí nghiệm hầu như không thay đổi, ở một số nghiệm thức thì giảm nhẹ và cũng tăng nhẹ ở một số nghiệm thức khác, nhưng trọng lượng chỉ thay đổi rất nhỏ. Ở NT1 trọng lượng chuột trung bình sau thí nghiệm giảm 0,41 g so với trước thí nghiệm. Ở NT2 trọng lượng chuột cũng giảm 0,26 g. Riêng NT3 thì trọng lượng chuột tăng 0,03g. Cuối cùng là lô đối chứng giảm 0,32 g so với trước thí nghiệm. Chuột giảm trọng lượng là do tiêu chảy, không ăn uống nên trọng lượng giảm nhanh, sau đó chúng khỏe hơn và ăn uống trở lại.
4.3. Tỷ lệ chuột sống sau khi dùng cao Cỏ lào điều trị
Sau khi điều trị, số chuột còn sống và khỏi bệnh được tổng kết và trình bày qua bảng 4.3.
Bảng 4.3: Tỷ lệ chuột sống sau khi điều trị (%) (N=12)
Chỉ tiêu ĐC NT1 NT2 NT3 n % n % n % n % Tỷ lệ chuột sống Sau 1 ngày 6 50,0b 7 58,3b 9 75ab 11 91,7a Sau 2 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 3 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 4 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 5 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 6 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Sau 7 ngày 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a Tỷ lệ khỏi bệnh 5 41,7b 5 41,7b 8 75ab 10 83,3a
Trị số trên cùng hàng có số mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) - n: số lượng chuột sống.
- N: tổng số lượng chuột.
Ở nghiệm thức đối chứng, không cho chuột uống cao Cỏ lào, tỷ lệ chuột còn sống sau 7 ngày theo dõi là 41,7% (tỷ lệ sống dưới 50%). Ở nghiệm thức thứ 1, cho chuột uống cao với liều 0,5 g/kgP thì tỷ lệ chuột sống sau 7 ngày điều trị là 41,7% (tỷ lệ sống dưới 50%). Đối với nghiệm thức thứ 2, chuột uống cao với liều 1,0 g/kgP thì tỷ lệ chuột khỏi bệnh sau 7 ngày điều trị là 75% (tỷ lệ khỏi bệnh trên 50%). Cuối cùng là nghiệm thức thứ 3, cho chuột uống cao với liều 1,5 g/kgP thì tỷ
29 lệ chuột khỏi bệnh sau điều trị đến 83,3%.
Qua bảng 4.3 cho thấy cao Cỏ lào có tác dụng tốt trong điều trị chuột bị nhiễm E. coli. Trong đó NT3 có hiệu quả điều trị cao nhất (83,3%), kế đến là NT2 (75%), cuối cùng là NT1 hiệu quả điều trị không cao (41,7%), kết quả này tương đương với nghiệm thức đối chứng (41,7%). Tuy nhiên, ở NT1 chuột chết chậm hơn so với đối chứng do cao Cỏ lào có thể kiềm hãm nhẹ được vi khuẩn E. coli. Sự khác nhau về hiệu quả điều trị giữa các nghiệm thức là do khác nhau về nồng độ cao Cỏ lào cho chuột uống. NT3 có hiệu quả cao nhất do chuột uống liều cao (1,5 g/kgP), do đó cao đủ khả năng khống chế được vi khuẩn. Còn NT1, chuột được uống cao với nồng độ thấp (0,5 g/kgP) nên không đủ ức chế vi khuẩn, vì thế hiệu quả điều trị thấp. Các nghiệm thức khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số liệu trên cũng đồng thời nói lên khi gây nhiễm E. coli, chuột chết trong 2 ngày đầu, sau ngày thứ 3 tỷ lệ này không thay đổi và giữ nguyên đến ngày thứ 7. Điều đó cho thấy nếu những chuột còn sống sau 2 ngày tiêm E. coli thì chuột sẽ
không chết và từ từ hồi phục. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Picard et al. (1999) cho rằng chuột bị nhiễm E. coli thường chết trong 18 giờ sau khi tiêm hoặc chết trong thời gian từ 1-3 ngày sau khi tiêm. Nếu chuột còn sống sau hơn 7 ngày là coi như sống sót lâu dài (Yousif et al., 2013).
4.4. Bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm
Sau 7 ngày điều trị tất cả chuột thí nghiệm đều được mổ khám. Bệnh tích đại thể của chuột khi mổ được thể hiện qua bảng 4.4.
Bảng 4.4: Tần suất xuất hiện bệnh tích trên chuột (N=28)
Loại bệnh tích
Số lượng (n) và tỷ lệ (%) chuột biểu hiện bệnh tích Trung bình NT ĐT (%) NT1 NT2 NT3 ĐC n % n % n % n % Lách to hơn 3 60 4 50 4 40 3 60 50
Dạ dày teo hoặc mỏng hơn 3 60 3 37,5 4 40 4 80 45,8
Thận bị hoại tử 2 40 2 25 2 20 2 40 28,3
Ruột (đặc biệt là manh tràng) chướng hơi và thành ruột rất mỏng.
2 40 2 25 1 10 3 60 25