a) Điều kiện sắc ký
Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung mơi, tốc độ dịng, chúng tơi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:
- Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 mm x 100 mm; 3,5 μm)
- Pha động: A (methanol): B (acid acetic 0,15%/ nước) với tỉ lệ A:B = 85:15 - Detector DAD: bước sĩng 203 nm
- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl - Nhiệt độ buồng cột: 25oC - Dung mơi pha mẫu: methanol
Kết quả là chúng tơi thu được sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid oleanolic
22
Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch acid oleanolic chuẩn
b) Thẩm định phương pháp phân tích * Chuẩn bị dung dịch
- Dung dịch chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn OA, hịa tan và định mức trong bình định mức 10 ml bằng MeOH được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 μg/ml.
+ Từ dung dịch chuẩn 1000 μg/ml tiến hành pha lỗng thành các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ 6,25 – 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 – 125 – 150 – 200 μg/ml.
- Dung dịch thử: Các mẫu cao khơ dược liệu sâm vũ diệp (được xử lý theo quy trình ở mục 3.1.1) pha trong MeOH.
- Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH (khơng cĩ chất chuẩn OA, cao sâm vũ diệp)
*Tính thích hợp hệ thống
Chuẩn bị một mẫu dung dịch OA chuẩn nồng độ 125 μg/ml. Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện như ở mục trên.
Xác định các thơng số sau mỗi lần tiêm: thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối và số đĩa lý thuyết của OA trên sắc ký đồ. Kết quả được thực nghiệm được trình bày ở bảng sau.
23
Bảng 3.1. Tính thích hợp hệ thống
Thí nghiệm Thời gian lưu (phút)
Diện tích pic (mAU.s)
Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết
1 10,589 736,04333 0,96 7216 2 10,722 740,36865 0,96 7105 3 10,736 737,54474 0,97 7128 4 10,749 734,65082 0,97 7174 5 10,746 738,55981 0,98 7176 6 10,753 733,58203 0,96 7160 TB 10,716 736,7916 0,967 7159 RSD (%) 0,538 0,3131 0,77 0,50
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,538% và 0,3131 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động từ 0,96 đến 0,98) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 7159 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC mà chúng tơi sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng acid oleanolic.
* Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích OA theo chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic OA trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung mơi pha mẫu khơng xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của OA (tR = 10,633 phút) (hình 3.3). Vậy phương pháp phân tích acid oleanolic xây dựng được cĩ độ đặc hiệu cao.
24
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu)
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic (đánh giá độ đặc hiệu)
*Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ 6,25 – 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 – 125 – 150 – 200 μg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng. Lập phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu (bảng 3.2). Phương trình hồi quy tuyến tính thu được thể hiện trong (hình 3.4).
25
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleanolic
Thí nghiệm Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s)
1 6,25 36,3144 2 12,5 75,7244 3 25 137,4189 4 50 314,7456 5 75 432,5359 6 100 534,8627 7 125 702,6413 8 150 850,8107 9 200 1078,3951
Phương trình hồi quy y = 5,4298x + 13,8966
Hệ số tương quan R2 = 0,9973
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic
Kết quả bảng 3.2 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát 6,25 –200 µg/ml cĩ sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ OA với hệ số tương quan rất cao (R2 = 0,9973), độ tuyến tính chặt.
y = 5,4298x + 13,8966 R² = 0,9973 0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 1200.0 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 D iệ n t íc h p ic ( m A U .s ) Nồng độ oleanolic acid
Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của acid oleanolic
26
*Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện: tiến hành pha lỗng mẫu phân tích OA đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được cĩ tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất.
Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.
Kết quả phân tích cho thấy phương pháp cĩ giới hạn phát hiện với OA là 1,5625 µg/ml, tương ứng cĩ giới hạn định lượng là 5,1563 µg/ml.
*Độ chính xác
Độ lặp lại
Tiến hành định lượng 6 mẫu dung dịch chuẩn OA nồng độ 50 µg/ml và chạy sắc ký với điều kiện như mục 3.2.1. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn
tương đối giữa giá trị của các lần định lượng. Kết quả xác định độ lặp lại được trình bày trong bảng sau.
Bảng 3.3. Kết quả độ lặp lại của phương pháp
Thí nghiệm Nồng độ dung dịch OA chuẩn (µg/ml) Diện tích pic OA (mAU.s) Nồng độ tính tốn (µg/ml) 1 50 302,7134 53,191 2 50 290,8605 51,008 3 50 296,4321 52,034 4 50 297,1183 52,161 5 50 293,7704 51,544 6 50 302,1475 54,008 Trung bình 52,324 RSD (%) 1,92
Kết quả cho thấy phương pháp cĩ độ lặp lại chấp nhận được, với giá trị RSD (%) khi tiến hành phân tích 6 dung dịch chuẩn OA nhỏ hơn 2%.
27
Độ đúng:
Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn. - Dung dịch thử
- Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu cao dược liệu 25 µg OA chuẩn. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký như quy trình đã được trình bày ở mục 3.2.1. Lặp lại thực nghiệm 6 lần khác nhau. Dựa vào đường chuẩn xây dựng, tính được lượng OA trong các mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả độ đúng của phương pháp
Thí nghiệm
Mẫu đã cĩ (µg)
Mẫu thêm vào (µg) Tổng lượng tìm lại (µg) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 110,63 25 135,39 99,05 2 109,35 25 134,34 99,99 3 106,25 25 131,84 102,35 4 111,06 25 135,75 98,74 5 112,97 25 137,31 97,37 6 104,76 25 130,64 103,53 Trung bình 100,17 RSD (%) 2,13
Kết quả cho thấy phương pháp cĩ độ đúng tốt: - Độ đúng trung bình cao: 100,17%
- Độ đúng của mỗi lần đều nằm trong khoảng từ 97,37% đến 103,53%