2.2.1. Phương pháp chiết xuất sâm vũ diệp
Nhiều cơng trình nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm vũ diệp cĩ chứa các saponin với phần sapogenin đã được xác định là OA. Vì vậy, để chiết xuất OA trong sâm vũ diệp, chúng tơi tiến hành tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu [4,11,13,14] để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với đối tượng nghiên cứu là rễ cây sâm vũ diệp.
Chúng tơi đã chọn ra quy trình chiết xuất sâm vũ diệp được thực hiện như sau: - Phương pháp chiết: đun hồi lưu cách thủy
- Dung mơi chiết xuất: ethanol 70% - Số lần chiết: 3 lần
- Thời gian chiết: 3 giờ/lần
2.2.2. Phương pháp phân tích HPLC
a) Lựa chọn điều kiện sắc ký
Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng OA trong trong cao sâm vũ diệp. Cụ thể, chúng tơi khảo sát các điều kiện như sau:
- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo;
- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dịng khác nhau;
18
- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phịng thí nghiệm;
- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.
b) Thẩm định phương pháp phân tích
* Độ đặc hiệu
Chuẩn bị các mẫu sau:
- Mẫu trắng: dung dịch MeOH - Mẫu OA chuẩn pha trong MeOH
So sánh các pic trên các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
*Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn OA pha trong MeOH cĩ nồng độ từ 1 – 200 μg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan R.
* Độ chính xác
Độ lặp lại
Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch chuẩn OA, xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ OA vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch sau:
- Dung dịch chuẩn cĩ nồng độ thích hợp.
19
- Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn bằng khoảng 40% lượng OA cĩ trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng.
Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính được phần trăm tìm lại so với lượng chuẩn thêm vào mẫu thử.
2.2.3. Phương pháp định lượng saponin tổng số
Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường gắn trên aglycone được thủy phân trong mơi trường acid để chuyển hết về dạng glycone. Do đĩ, saponin tổng số được định lượng thơng qua acid oleanolic [6].
3 COOR2 28 R1O H+, toC 3 COOH 28 HO
Hình 2.2. Cơ sở phương pháp thủy phân các saponin khung oleanan từ sâm vũ diệp
- Chuẩn bị mẫu phân tích OA: Cân cao SVD hịa tan trong MeOH. Lọc qua màng lọc 0,2 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.
- Chuẩn bị mẫu phân tích OA tổng số: Cân cao SVD cho vào bình cổ nhám. Thêm nước nĩng, ủ tại 90ºC trong 10 phút. Thêm HCl đậm đặc và đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết bằng dicloromethan. Pha dicloromethan cơ quay tới gần cạn. Hịa tan phần cặn bằng MeOH, lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm.
- Quy trình HPLC phân tích và định lượng OA và saponin tổng số: Điều kiện sắc ký như đã khảo sát
- Phương pháp tính tốn hàm lượng OA và saponin tổng số trong mẫu được thực hiện theo phương pháp ngoại chuẩn:
+ Pha dãy dung dịch chuẩn OA.
+ Từ sắc ký đồ thu được của các điểm chuẩn, lấy tín hiệu diện tích pic của từng điểm chuẩn được các giá trị diện tích pic, dựng đường tuyến tính diện tích pic theo
20
nồng độ thu được hàm số bậc nhất: y = ax + b (y là diện tích pic, x là nồng độ dung dịch chuẩn OA).
+ Từ sắc ký đồ của các mẫu phân tích, lấy diện tích pic của OA thu được giá trị S mẫu. Giá trị S mẫu được áp vào đường tuyến tính y = ax + b sẽ thu được giá trị nồng độ OA trong mẫu. Quá trình thủy phân mẫu giúp chuyển các saponin về dạng acid oleanoic. Do đĩ, hàm lượng saponin tổng số (Msaponin tổng số) được tính bằng cách lấy hàm lượng OA sau thủy phân (MOA STP) trừ cho hàm lượng OA khơng thủy phân (MOA KTP)
Msaponin tổng số = MOA STP – MOA KTP
Trong đĩ, hàm lượng acid oleanolic được tính theo phương pháp ngoại chuẩn.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Một số cơng thức tính tốn trong xử lý thống kê kết quả: - Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007
- Giá trị trung bình: n 1 i i x x n 1 - Độ lệch chuẩn: 1 n S 1 i 2 x xi
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 x
S
21
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Quy trình chiết xuất sâm vũ diệp
Mẫu rễ SVD (500 g) sau khi rửa sạch, phơi khơ, thái nhỏ được ngâm chiết kỹ bằng dung mơi ethanol 70% 3 lần (mỗi lần 1500 ml) sử dụng thiết bị chiết hồi lưu trong 3 giờ/lần. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung mơi dưới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol, độ ẩm 4,7%.
3.1.2. Xây dựng quy trình định lượng
a) Điều kiện sắc ký
Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung mơi, tốc độ dịng, chúng tơi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:
- Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 mm x 100 mm; 3,5 μm)
- Pha động: A (methanol): B (acid acetic 0,15%/ nước) với tỉ lệ A:B = 85:15 - Detector DAD: bước sĩng 203 nm
- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl - Nhiệt độ buồng cột: 25oC - Dung mơi pha mẫu: methanol
Kết quả là chúng tơi thu được sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid oleanolic
22
Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch acid oleanolic chuẩn
b) Thẩm định phương pháp phân tích * Chuẩn bị dung dịch
- Dung dịch chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn OA, hịa tan và định mức trong bình định mức 10 ml bằng MeOH được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 μg/ml.
+ Từ dung dịch chuẩn 1000 μg/ml tiến hành pha lỗng thành các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ 6,25 – 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 – 125 – 150 – 200 μg/ml.
- Dung dịch thử: Các mẫu cao khơ dược liệu sâm vũ diệp (được xử lý theo quy trình ở mục 3.1.1) pha trong MeOH.
- Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH (khơng cĩ chất chuẩn OA, cao sâm vũ diệp)
*Tính thích hợp hệ thống
Chuẩn bị một mẫu dung dịch OA chuẩn nồng độ 125 μg/ml. Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện như ở mục trên.
Xác định các thơng số sau mỗi lần tiêm: thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối và số đĩa lý thuyết của OA trên sắc ký đồ. Kết quả được thực nghiệm được trình bày ở bảng sau.
23
Bảng 3.1. Tính thích hợp hệ thống
Thí nghiệm Thời gian lưu (phút)
Diện tích pic (mAU.s)
Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết
1 10,589 736,04333 0,96 7216 2 10,722 740,36865 0,96 7105 3 10,736 737,54474 0,97 7128 4 10,749 734,65082 0,97 7174 5 10,746 738,55981 0,98 7176 6 10,753 733,58203 0,96 7160 TB 10,716 736,7916 0,967 7159 RSD (%) 0,538 0,3131 0,77 0,50
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử lần lượt là 0,538% và 0,3131 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 (dao động từ 0,96 đến 0,98) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 7159 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng hệ thống HPLC mà chúng tơi sử dụng là thích hợp để định tính, định lượng acid oleanolic.
* Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích OA theo chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic OA trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung mơi pha mẫu khơng xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của OA (tR = 10,633 phút) (hình 3.3). Vậy phương pháp phân tích acid oleanolic xây dựng được cĩ độ đặc hiệu cao.
24
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu)
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic (đánh giá độ đặc hiệu)
*Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ 6,25 – 12,5 – 25 – 50 – 75 – 100 – 125 – 150 – 200 μg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng. Lập phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu (bảng 3.2). Phương trình hồi quy tuyến tính thu được thể hiện trong (hình 3.4).
25
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleanolic
Thí nghiệm Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s)
1 6,25 36,3144 2 12,5 75,7244 3 25 137,4189 4 50 314,7456 5 75 432,5359 6 100 534,8627 7 125 702,6413 8 150 850,8107 9 200 1078,3951
Phương trình hồi quy y = 5,4298x + 13,8966
Hệ số tương quan R2 = 0,9973
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic
Kết quả bảng 3.2 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát 6,25 –200 µg/ml cĩ sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ OA với hệ số tương quan rất cao (R2 = 0,9973), độ tuyến tính chặt.
y = 5,4298x + 13,8966 R² = 0,9973 0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 1200.0 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 D iệ n t íc h p ic ( m A U .s ) Nồng độ oleanolic acid
Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của acid oleanolic
26
*Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện: tiến hành pha lỗng mẫu phân tích OA đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được cĩ tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với từng chất.
Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.
Kết quả phân tích cho thấy phương pháp cĩ giới hạn phát hiện với OA là 1,5625 µg/ml, tương ứng cĩ giới hạn định lượng là 5,1563 µg/ml.
*Độ chính xác
Độ lặp lại
Tiến hành định lượng 6 mẫu dung dịch chuẩn OA nồng độ 50 µg/ml và chạy sắc ký với điều kiện như mục 3.2.1. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn
tương đối giữa giá trị của các lần định lượng. Kết quả xác định độ lặp lại được trình bày trong bảng sau.
Bảng 3.3. Kết quả độ lặp lại của phương pháp
Thí nghiệm Nồng độ dung dịch OA chuẩn (µg/ml) Diện tích pic OA (mAU.s) Nồng độ tính tốn (µg/ml) 1 50 302,7134 53,191 2 50 290,8605 51,008 3 50 296,4321 52,034 4 50 297,1183 52,161 5 50 293,7704 51,544 6 50 302,1475 54,008 Trung bình 52,324 RSD (%) 1,92
Kết quả cho thấy phương pháp cĩ độ lặp lại chấp nhận được, với giá trị RSD (%) khi tiến hành phân tích 6 dung dịch chuẩn OA nhỏ hơn 2%.
27
Độ đúng:
Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn. - Dung dịch thử
- Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu cao dược liệu 25 µg OA chuẩn. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký như quy trình đã được trình bày ở mục 3.2.1. Lặp lại thực nghiệm 6 lần khác nhau. Dựa vào đường chuẩn xây dựng, tính được lượng OA trong các mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả độ đúng của phương pháp
Thí nghiệm
Mẫu đã cĩ (µg)
Mẫu thêm vào (µg) Tổng lượng tìm lại (µg) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 110,63 25 135,39 99,05 2 109,35 25 134,34 99,99 3 106,25 25 131,84 102,35 4 111,06 25 135,75 98,74 5 112,97 25 137,31 97,37 6 104,76 25 130,64 103,53 Trung bình 100,17 RSD (%) 2,13
Kết quả cho thấy phương pháp cĩ độ đúng tốt: - Độ đúng trung bình cao: 100,17%
- Độ đúng của mỗi lần đều nằm trong khoảng từ 97,37% đến 103,53%
3.1.3. Định lượng acid oleanolic trong dược liệu và cao sâm vũ diệp
Chuẩn bị mẫu phân tích acid oleanolic: cân 6 mẫu cao sâm vũ diệp, hịa tan bằng MeOH. Siêu âm, lọc qua màng lọc kích thước 0,2 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC
28
- Điều kiện sắc ký: như mục 3.2.1.
- Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của OA trên sắc ký đồ thu được.
- Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để phân tích hàm lượng OA trong mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu đề tài cho kết quả ở
bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả định lượng acid oleanolic trong dược liệu và sâm vũ diệp
Thí nghiệm Khối lượng cao (g) Nồng độ mẫu thử (µg/ml) Diện tích pic OA (mAU.s) Hàm lượng OA trong cao (%) Hàm lượng OA trong dược liệu
khơ (%) 1 0,0921 100.000 195,0779 0,033 0,0064 2 0,0839 100.000 191,8679 0,033 0,0063 3 0,0955 100.000 207,1301 0,036 0,0068 4 0,1054 100.000 203,1252 0,035 0,0067 5 0,0896 100.000 197,9458 0,034 0,0065 6 0,0942 100.000 205,0432 0,035 0,0068 Trung bình 0,034 0,0066 RSD (%) 2,95
Kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp là 0,034% và trong dược liệu sâm vũ diệp là 0,0066%.
3.1.4. Định lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp
Chuẩn bị mẫu phân tích OA: Cân cao sâm vũ diệp hịa tan trong MeOH. Lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC
Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng số: Cân khoảng 0,2 g cao dược liệu cho vào bình cổ nhám. Thêm 50ml nước nĩng, ủ tại 90ºC trong 10 phút. Thêm 7,5 ml HCl đậm đặc và đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x 100 ml
29
dicloromethan. Pha dicloromethan cơ quay tới gần cạn. Hịa tan phần cặn bằng 2ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,2 micro trước khi tiêm.
- Điều kiện sắc ký: như mục 3.1.2 - Tính kết quả:
+ Ghi lại diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử khơng thủy phân, tính nồng độ OA cĩ trong mẫu thử dựa trên đường tuyến tính đã lập. Từ đĩ tính hàm lượng OA trong cao SVD.
+ Tương tự tính hàm lượng OA trong mẫu thử sau thủy phân. + Từ đĩ tính hàm lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp.
Msaponin tổng số = MOA STP – M OA KTP
Kết quả tính tốn hàm lượng saponin tổng số trong cao sâm vũ diệp trong bảng sau:
Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng saponin tổng số trong dược liệu và cao sâm vũ diệp
STT Khối lượng cao (g) Khối lượng cắn STP (g) Nồng độ cao STP (µg/ml) MOA STP trong cao SVD (%) 1 0,2171 0,036 18000 0,380 2 0,2223 0,038 19000 0,407 3 0,2055 0,035 17500 0,409 Trung bình 0,398
Msaponin tổng số trong cao SVD (%) 0,364