dưới mặt đất đạm trúc diệp
5,0 kg dược liệu khô phần dưới mặt đất của đạm trúc diệp được chiết hồi lưu với EtOH 70% (3 lần, mỗi lần 3 giờ). Lọc, gộp dịch chiết và cô dưới áp suất giảm đến cao khô (210,0 g). Cao khô được hòa trong nước và lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Hx, DCM và EtOAc. Cất
thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết phân đoạn tương ứng gồm cao n-hexan (30,9 g), dicloromethan (9,4 g), ethyl acetat (7,2 g) và cặn nước (134,9 g).
Cao n-hexan được phân tách trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi gradient Hx-EtOAc (100:0~1:2) thu được 11 phân đoạn nhỏ, ký hiệu là L2LG1B3A~L2LG1B3L. Phân đoạn L2LG1B3L (2,2 g) tiếp tục được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi gradient DCM-Ac (16:1~6:1) thu được phân đoạn LG01, LG02 và LG03. Tinh chế phân đoạn LG03 (280 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi Hx-Ac (4:1) thu được hợp chất 1
(LGH1, 170 mg). Phân đoạn L2LG1B3B (1,1 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường, , rửa giải bằng hệ dung môi gradient Hx-Ac (9:1~5:1), thu 3 phân đoạn, ký hiệu L2LG1B3B1~ L2LG1B3B3. Hợp chất 2
(LGH2, 320 mg) được tinh chế từ phân đoạn L2LG1B3B2 (522,2 mg) bằng cách kết tinh trong dung môi DCM - MeOH (1:1) và aceton.
Cao ethyl acetat được đưa lên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi gradient Hx - Ac (20:0~1:3) thu được 5 phân đoạn L2LG1D2A→L2LG1D2E. Phân đoạn L2LG1D2A (200 mg) được phân tách bằng cột sắc ký silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi Hx - Ac (3:1) thu được hợp chất 3 (LGE1, 7 mg) và hợp chất 4 (LGE2, 14,1 mg).
SKC /Hx - Ac (20:0~1:3)
SKC /Hx-Ac
(9:1~5:1)
Hòa trong nước
Lắc lần lượt với: Hx, DCM, EtOAc.
Phần dưới mặt đất đạm trúc diệp m = 5,0 kg L2LG1B3C ~ L2LG1B3K m = 2,2 g L2LG1B3B2 m = 522,2 mg LG01, LG02 LGH2 m = 320 mg LGH1 m = 170 mg Cắn phân đoạn n-hexan
m = 30,9 g
L2LG1B3A
Cao chiết ethanol 70% m = 210,0 g
Chiết hồi lưu với EtOH 70%
(3 lần, mỗi lần 3 giờ)
Lọc, gộp dịch chiết
Cô dưới áp suất giảm
Cắn phân đoạn DCM m = 9,4 g
Cắn phân đoạn EtOAc m = 7,2 g Cặn nước m = 134,9 g L2LG1B3B m = 1,1 g L2LG1B3L m = 2,2 g LG03 m = 280 mg SKC /DCM-Ac (16:1~6:1) SKC /Hx-Ac (4:1) L2LG1B3B1, L2LG1B3B2 Kết tinh /DCM - MeOH (1:1) và aceton L2LG1D2A m = 0,2 g L2LG1D2B ~ L2LG1D2E LGE1 m = 7 mg LGE2 m =14,1 mg SKC /Hx - Ac (3:1) SKC /Hx - EOAc (100:0~1:2)
- Hợp chất 1: LGH1 (Bộ dữ liệu phổ được đính kèm tại phụ lục 2)
Dạng vô định hình màu trắng, hiện màu từ tím hồng sang xanh tím với thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH 96% khi hơ nóng trên bếp điện. Nhiệt độ nóng chảy là 290 - 2940C. Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3 và MeOD) δ: 5,37 (1H, brd, H-6); 3,56 (1H, m, H-3); 1,01 (3H, s, H-19); 0,69 (3H, s, H- 20); 0,92 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-21); 0,83 (3H, d, J = 1,6 Hz, H-26); 0,81 (3H, brs, H-27); 0,85 (3H, brs, H-29); 4,41 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′). Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3 và MeOD) δ: 37,2 (C-1); 29,5 (C-2); 70,1 (C- 3); 42,2 (C-4); 140,2 (C-5); 122,0 (C-6); 31,80 (C-7); 31,83 (C-8); 50,1 (C- 9); 36,6 (C-10); 20,9 (C-11); 39,7 (C-12); 42,2 (C-13); 56,7 (C-14); 24,2 (C-15); 28,1 (C-16); 55,9 (C-17); 11,8 (C-18); 19,6 (C-19); 36,0 (C-20); 18,6 (C-21); 33,9 (C-22); 26,0 (C-23); 45,8 (C-24); 29,1 (C-25); 19,6 (C- 26); 18,9 (C-27); 22,9 (C-28); 11,7 (C-29); Glc: 101,02 (C-1′); 73,46 (C- 2′); 75,62 (C-3′); 70,08 (C-4′); 79,12 (C-5′); 61,82 (C-6′)
Phổ NMR của 1 có dạng phổ của một hợp chất sterol-glycosid. Trên phổ NMR của 1 ngoài các tín hiệu của khung sterol, còn xuất hiện các tín hiệu của một phân tử đường glucose, đồng thời trên phổ 13
C-NMR tín hiệu của C-3 đã bị dịch chuyển mạnh về phía trường thấp hơn do đã tạo liên kết glycosid tại C-3. Phổ 1
H-NMR xuất hiện tín hiệu của một nối đôi thế ba lần tại 5,37 (1H, br, H-6), một nhóm methin carbinol tại 3,56 (1H, m, H-3). Ngoài ra còn các tín hiệu của các nhóm methyl tại 0,68 (3H, s, H-18); 1,00 (3H, s, H-19); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21); 0,81 (3H, d, J = 7,6 Hz, H-26); 0,83 (3H, d, J = 7,6 Hz, H-27); 0,84 (3H, t, J = 7,3 Hz, H-29) và tín hiệu dễ nhận biết của proton anome của phân tử đường glucose tại 4,41 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-1′). Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 35 carbon, trong đó có 29 carbon thuộc khung của hợp chất -sitosterol và 6 carbon thuộc vào phân tử đường glucose. Trong cấu trúc aglycon, nối đôi
được xác định tại 140,20 (C-5), 122,0 (C-6), carbon methin nối với oxi tại 76,30 và 6 tín hiệu của phân tử đường được xác định tại 101,0 (d, C- 1′); 73,46 (d, C-2′); 75,62 (d, C-3′); 70,08 (d, C-4′); 79,12 (d, C-5′); 61,82 (t, C-6′). Các dữ kiện phổ NMR của 1 hoàn toàn phù hợp đem so sánh với các dữ kiện phổ đã được công bố [41] kết hợp chấm sắc ký đối chứng cho hợp chất daucosterol (Sắc kí đồ được trình bày tại hình 3.9).
Hệ dung môi: Toluen-Ethyl acetat-Aceton-Acid formic (3:2:2:2) Thuốc thử hiện màu: H2SO4 10% trong EtOH 96%
Hình 3.9. Sắc ký đồ của hợp chất 1 và daucosterol (Da)
- Hợp chất 2: LGH2(Bộ dữ liệu phổ được đính kèm tại phụ lục 3) Dạng tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy là 133 - 1350
C, tan trong chloroform, không tan trong methanol, không hấp thụ UV. Trên sắc ký bản mỏng, sau khi nhúng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% và hơ nóng trên bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng tươi rồi xanh tím dần. Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 0,68 (3H, s, H-18); 0,83 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-27); 0,81 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-26); 0,84 (3H, t, J = 7,5 Hz, H- 29); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21); 1,01 (3H, s, H-19); 3,54 (tt; 5,1; 11,7); 5,37 (1H, br d, J = 5,1 Hz, H-6). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3)δ: 11,9 (C-18); 12,0 (C-29); 18,8 (C-21); 19,8 (C-27); 19,4 (C-19); 19,1 (C-26); 21,1 (C-11); 23,1 (C-28); 24,3 (C-15); 26,1 (C-23); 28,3 (C-16); 29,2 (C- 25); 31,67 (C-2); 31,9 (C-8); 31,9 (C-7); 33,9 (C-22); 36,2 (C-20); 36,5 (C-
10); 37,3 (C-1); 39,8 (C-12); 42,3 (C-4); 42,3 (C-13); 45,9 (C-24); 50,2 (C- 9); 56,1 (C-17); 56,8 (C-14); 71,8 (C-3); 121,7 (C-6); 140,8 (C-5).
Hợp chất 2 thu được dưới dạng tinh thể hình kim không màu. Trên sắc ký lớp mỏng, với TT H2SO4 10%/EtOH 96% hợp chất này cho màu hồng tươi rồi xanh tím dần dần chứng tỏ đây là một steroid.Trên phổ 1
H-NMR của chất xuất hiện tín hiệu đặc trưng cho hydroxy methin δH 3,54 (tt, J = 5,1; 11,7 Hz, H-3), thêm vào đó sự có mặt của nhóm methin olefinic thể hiện qua tín hiệu ở δH 5,37 (br d; 5,1, H-6). Ngoài ra 6 tín hiệu của nhóm methyl còn lại độ chuyển dịch δH 0,68 (3H; s, H-18); 0,83 (3H, d, J =7,5 Hz, H-27); 0,81 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-26); 0,84 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21); 1,01 (3H, s, H-19) cho các giả thuyết về một phần cấu trúc đặc trưng cho terpen khung stigmastan. Phổ 13C cho thấy
2 có 29 C, tín hiêu đặc trưng của liên kết olefinic có độ chuyển dịch δC
121,7 (C-6) và 140,8 (C-5). Độ chuyển dịch δC 71,8 (C-3) đặc trưng cho nhóm methin gắn với nhóm hydroxi. Thêm vào đó là tín hiệu của 6 nhóm methyl tại δC 11,9 (C-18); 12,0 (C-29); 18,8 (C-21); 19,8 (C-27), 19,4 (C- 19); 19,1 (C-26). Từ việc phân tích phổ và dựa vào tài liệu đã công bố [41] kết hợp chấm sắc kí đối chứng khẳng định 2 là Stigmast-5-en-3-ol hay còn gọi là β-sitosterol (Sắc kí đồ được trình bày tại hình 3.10).
n-Hexan-Ethyl acetat(6:1) n-Hexan-Aceton(8:1)
Thuốc thử hiện màu: H2SO4 10% trong EtOH 96%
- Hợp chất 3: LGE1(Bộ dữ liệu phổ được đính kèm tại phụ lục 4)
Hợp chất 3 có dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Phổ ESI-MS cho pic ion ở ở m/z 433,67 [M+H]+ . Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ aglycon 6,77 (1H, s, H-3); 6,27 (1H, s, H-6); 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′); glc: 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-1″); 3,84 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-2″); 3,24-3,35 (3H, m, H-3″, 4″, 5″); 3,76 (1H, br d, J = 9,0 Hz, Hb-6″); 3,53 (1H, t, J = 5,5 Hz, Ha-6″). Phổ 13C-NMR δ: 163,9 (C-2); 102,4 (C-3); 182,1 (C-4); 160,4 (C-5); 98,1 (C-6); 161,1 (C-7); 104,6; (C-8); 155,9 (C- 9); 104,0 (C-10); 121,6 (C-1′); 128,9 (C-2′, 6′); 115,8 (C-3′, 5′); 161,1 (C- 4′); 73,4 (C-1″); 70,8 (C-2″); 78,7 (C-3″); 70,6 (C-4″); 81,8 (C-5″); 61,3 (C-6″).
Hợp chất 3 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Phổ ESI-MS của chất 3 cho pic ion ở m/z 433,67 [M+H]+ phù hợp với khối lượng phân tử 432 (C21H20O10). Hợp chất 3 đã được xác định là một flavon
C-glucosid dựa trên các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ
1
H-NMR (DMSO-d6) của hợp chất 3 cho các tín hiệu proton trong hai vòng thơm của một flavon trong đó có một tín hiệu singlet của proton duy nhất trong vòng A [δH 6,77 (1H, s, H-6)], hai tín hiệu doublet của proton vòng B tương tác ortho với nhau [δH 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) và 6,86 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3′, 5′)]; tín hiệu singlet của một proton methin [δH 6,27 (1H, s, H-3)] và các tín hiệu ở trường thấp của nhóm 5-OH tạo liên kết hydro với nhóm carbonyl ở C-4 ở δH 13,16. Trên phổ còn cho tín hiệu của gốc đường glucose liên kết với aglycon qua liên kết β-C-glycosid đặc trưng bởi proton anomeric ở [δH 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-1″)] và các tín hiệu khác 3,84 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-2″); 3,24-3,35 (3H, m, H-3″, 4″, 5″); 3,76 (1H, br d, J = 9,0 Hz, Hb-6″); 3,53 (1H, t, J = 5,5 Hz, Ha-6″). So sánh các tín hiệu cộng hưởng từ carbon 13 của chất 3 với của apigenin đã xác định được chất 3 là một apigenin C-glucosid [19]. Các sự thay đổi độ chuyển
dịch hóa học quan sát được chủ yếu ở C-7 (∆δC -1,6), C-8 (∆δC +10,0) và C-9 (∆δC -1,4). Gốc đường đã được xác định là một nhóm glucopyranosyl dựa trên các phổ 13C-NMR và DEPT [δC 61,3 (t); 70,6 (d); 70,8 (d); 73,4 (d); 78,6 (d) và 81,8 (d)]. Các giá trị δC đã hoàn toàn xác định khả năng liên kết của nhóm glucopyranosyl vào C-8 của vòng A của apigenin gây ra sự chuyển dịch δC ở các vị trí C-7, C-8 và C-9. Trên cơ sở các dữ kiện phổ của
3, kết hợp với tham khảo tài liệu [51], hợp chất 3 đã được xác định là apigenin 8-C-β-D-glucopyranosid hay vitexin.
- Hợp chất 4: LGE2(Bộ dữ liệu phổ được đính kèm tại phụ lục 5)
Dạng bột màu trắng. Phổ ESI-MS cho pic giả phân tử ở m/z: 142,7 [M+NH3]+ (positive) tương ứng với công thức phân tử C6H6O3 (M = 126). Phổ 1 H-NMR (500 Hz, CD3OD): δ9,56 (1H, s, -CHO); 7,40 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-3); 6,60 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-4); 4,85 (2H, s, -CH2OH). Phổ 13 C- NMR (125 Hz, CD3OD): δ 179,4 (-CHO); 163,2 (C-5); 153,9 (C-2); 124,8 (C-3); 110,9 (C-4); 57,6 (-CH2OH). Phổ 13
C-NMR và phổ DEPT của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 6 carbon trong đó có 4 tín hiệu carbon có độ chuyển dịch từ 110,9 ppm đến 163,2 ppm nằm trong vùng thơm hoặc liên kết đôi C=C bao gồm 2 carbon bậc bốn [δC 153,9 (C-2) và 163,2 (C-5)] và 2 methin carbon [δC 124,8 (C-3) và 110,9 (C-4)]. Tín hiệu carbon của nhóm -C=O và nhóm -CH2 đính với nguyên tử oxy xuất hiện ở độ chuyển dịch lần lượt là 179,4 ppm và 57,6 ppm. Phổ 1
H-NMR của hợp chất 4 có 2 tín hiệu của proton olefin xuất hiện dưới dạng pic kép ở độ chuyển dịch 6,60 (1H, d, J = 3,5 Hz) và 7,40 (1H, d, J = 3,5 Hz), một proton của nhóm carbaldehyd δH = 9,56 (1H, s). Dựa vào tất cả dữ kiện phổ khẳng định chất 4 là hợp chất hữu cơ thơm, có vòng furan bị thế bởi hai nhóm thế; một nhóm carbaldehyd và một nhóm hydroxymethyl. Phổ ESI-MS cho pic giả phân tử ở m/z: 142,7 [M+NH3]+ (positive) tương ứng với công thức phân tử C6H6O3 (M = 126). Từ những
dữ liệu trên đối chiếu với tài liệu [35] đã công bố hợp chất 4 được xác định là 5-(hydroxymethyl)furan-2-carbaldehyd hay hydroxymethylfurfural
Hình 3.11. Công thức cấu tạo của các hợp chất từ phần dưới mặt đất