2.2.2.1. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ
Định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [12], [8].
- Chuẩn bị dịch chiết ethanol: Cho 20 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml EtOH 700, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng.
- Chuẩn bị dịch chiết n-hexan: Cho 10 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, đổ ngập n-hexan, ngâm qua đêm, lọc. Dịch lọc dùng để làm các phản ứng.
- Chuẩn bị dịch chiết nước: 20 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng.
a) Định tính alcaloid
Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm dung dịch H2SO4 2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH kiềm. Chiết alcaloid bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml. Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 2%. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào:
- Ống 1: TT Mayer. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.
- Ống 2: TT Dragendorff. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu. - Ống 3: TT Bouchardat. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng
cam đến đỏ.
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 h. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 250 ml. Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30% khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc cỏ mỏ dung tích 250 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với CHCl3:MeOH (4:1) mỗi lần 8 ml. Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc cỏ mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan. Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:
- Phản ứng Liebermann-Burchardt: cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu tím đỏ giữa 2 lớp chất.
- Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 800
. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện dung dịch màu đỏ.
- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 800
. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam.
c) Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 10 ml dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút. Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml n-hexan. Lấy 1 ml dịch n-hexan cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, lắc kỹ, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ ở lớp KOH.
- Phản ứng Cyanidin: cho 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 − 5 giọt). Để yên một vài phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu đỏ cam.
- Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt NaOH 10%, quan sát xem có kết tủa hay không, sau đó thêm nước, quan sát màu của dung dịch. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu. - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol. Thêm vào 2 − 3 giọt dd FeCl3, Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu lục, xanh, hoặc nâu.
e) Định tính coumarin
- Phản ứng mở và đóng vòng lacton:
+ Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết ethanol, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên.
+ Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội. Quan sát hiện tượng. + Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều, quan sát và mô tả hiện tượng.
- Phản ứng với thuốc thử diazo: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ gạch.
f) Định tính saponin
- Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to sạch 2 ml dịch chiết nước, thêm 10 ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống nghiệm, để yên, Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút.
- Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết ethanol cho vào bình nón và thêm 10 ml H2SO4 loãng. Đun sôi cách thủy vài phút. Để nguội, chiết với cloroform. Lấy khoảng 2 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm.
Thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, đỏ, xanh lá hoặc tím.
- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết cloroform ở trên cho vào 1 ống nghiệm rồi cô tới cắn. Cho vào cắn 0,5 ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 450
rồi thêm 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp. Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện màu hồng đến tía .
g) Định tính tanin
Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau:
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm dịch chiết 2 − 3 giọt dd FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh lá đến xanh đen.
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2 − 3 giọt dung dịch gelatin 1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
- Phản ứng với chì acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết đạm trúc diệp 2 − 3 giọt dung dịch chì acetat 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
- Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết đạm trúc diệp 2 − 3 giọt đồng acetat. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
h) Định tính acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước đạm trúc diệp một ít tinh thể Na2CO3. Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí.
Lấy 2 ml dịch chiết đạm trúc diệp vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2 – 3 ml giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu tím.
j) Định tính đường khử
Lấy 2 ml dịch chiết nước đạm trúc diệp, thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu đỏ gạch.
k) Định tính polysaccharid
Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống:
Ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol.
Ống 2: 4 ml dịch chiết đạm trúc diệp và 5 giọt thuốc thử Lugol. Phản ứng dương tính khi xuất hiện mài nâu đỏ.
l) Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vết mờ trên giấy lọc.
m) Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống nghiệm 450
nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ.
n) Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi cách thủy đến cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn. Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu xanh.
2.2.2.2. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hợp chất trong đạm trúc diệp
- Phương pháp chiết xuất: Dược liệu được chiết hồi lưu ở 80oC với dung môi ethanol 70% trong thời gian 3h x 3 lần; tỉ lệ dược liệu/dung môi
là 1:10; phân đoạn bằng dung môi công nghiệp theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat [6].
- Phương pháp phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột, tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo YMC [5].
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất: Dựa trên kết quả phân tích các tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố.
2.2.2.3. Định lượng polyphenol toàn phần trong đạm trúc diệp
Phương pháp định lượng polyphenol tổng số: sử dụng thuốc thử Folin- Ciocalteau, đo quang ở bước sóng 760 nm, so sánh với acid gallic, sử dụng kỹ thuật đường chuẩn, dựa theo Dược điển Việt Nam IV [3]. Phương pháp định lượng như sau:
- Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg acid gallic, cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH, siêu âm cho tan hoàn toàn. Bổ sung MeOH tới vạch, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1000 µg /ml. Dung dịch gốc được dùng để pha các dung dịch chuẩn có nồng độ 200-1000 µg /ml.
- Dung dịch mẫu thử: đối với cao tổng và cao phân đoạn dicloromethan, nước: cân chính xách khoảng 100 mg cao chiết, cho vào bình định mức 10ml, thêm MeOH, siêu âm cho tan hoàn toàn. Thêm dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc kích cỡ 0.45 mm, thu được dung dịch thử dùng để pha dung dịch đo quang.
Đối với phân đoạn ethyl acetat: cân chính xác khoảng 50 mg cao chiết, cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH tới vạch, siêu âm cho tan hoàn toàn, lọc qua màng lọc kích cỡ 0.45 mm, thu được dung dịch thử để pha dung dịch đo quang.
- Dung dịch đo quang: Cho 100 µl dung dịch thử/ dung dịch chuẩn + 200 µl thuốc thử Folin-Ciocalteau + 1,8ml nước cất, lắc kỹ và để yên 5 phút. Thêm 4 ml Na2CO3 7% và bổ sung nước cất vừa đủ 10,0 ml. Ủ ở nhiệt độ phòng 90 phút rồi đem đi đo quang ở 760 nm.
Xử lý kết quả:
- Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang và nồng độ chất đối chiếu trong dung dịch đo quang Y=a.X+b.Trong đó, Y là độ hấp thụ quang của dung dịch, X là nồng độ chất đối chiếu trong dung dịch đo quang.
- Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao dược liệu được xác định dựa trên công thức sau:
X = Y - b x 100 x 10 x 100 x 1000 (mg GAE /g) a m x (100 - x) x 1000
Trong đó:
X: hàm lượng polyphenol trong cao tính theo đương lượng acid gallic (mg GAE /g)
Y: độ hấp thụ quang của dung dịch thử ở 760 nm a,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn m: khối lượng cao dược liệu (mg)
x: độ ẩm cao (%)