3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.4Phương pháp phân lập, giám ựịnh số lượng và số loại
trong mẫu phân chó Béc giê khỏe mạnh và chó bệnh.
* Phương pháp xử lý mấu:
Mẫu lấy về nếu chưa kịp xử lý ngay sẽ ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 40C.
* Xác ựịnh số lượng vi khuẩn có trong 1 gram phân.
Chúng tôi sử dụng hệ nồng ựộ pha loãng dưới ựây rồi ựếm số lượng vi khuẩn theo phương pháp Koch:
1ml 1ml 1ml 1ml
1g phân
1 2 3 Ầ x
Sơ ựồ 3.1: Hệ nồng ựộ pha loãng mẫu phân
Ống 1 2 3 Ầ X Phân (g) 1 Nước cất 2 lần (ml) 9 9 9 9 9 Tỷ lệ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10- 10-x
Cân 1 gram phân cho vào ống nghiệm vô trùng nghiền nát với 9ml nước sinh lắ ta ựược nồng ựộ pha loãng 10-1, dùng syrige vô trùng trộn ựều nhiều lần. Sau ựó hút 1ml dung dịch này sang ống thứ 2 ựựng 9ml nước sinh lắ vô trùng, trộn ựều, tiếp tục làm như vậy ựến nồng ựộ pha loãng thắch hợp ựể nuôi cấỵ
Cách nuôi cấy: Dùng syrige vô trùng hút 0,1ml dịch pha loãng ở các nồng ựộ ựã chọn vào một ựĩa môi trường. Cấy bằng phương pháp láng ựều
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
dịch pha loãng trên bề mặt thạch. Sau ựó ựể các ựĩa thạch vào tủ ấm 37ồC/24h lấy ra ựọc kết quả bằng cách ựếm số lượng khuẩn lạc có trong một ựĩạ Mỗi nồng ựộ chuẩn cho từng loại phân, rồi cấy ra 3 ựĩa thạch ựếm số lượng khuẩn lạc (CFU) trong 3 ựĩa thạch rồi lấy số lượng trung bình. Số lượng CFU tương ựương với số lượng vi khuẩn.
* Tắnh kết quả:
Nếu tiến hành pha loãng mẫu ở nồng ựộ x và cấy 0,1ml mẫu pha loãng vào môi trường, ựể tủ ấm nuôi cấy sau 24h thì khi ựó số lượng vi khuẩn (X) trong 1 gram phân tắnh theo công thức:
X=10.ạb
Trong ựó: X là tổng số vi khuẩn có trong 1 gam phân a: là số khuẩn lạc trung bình trên 1 ựĩa thạch Petrị b: nồng ựộ pha loãng 10-x
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường ựể trong tủ ấm 37ồC/24 giờ, ựếm khuẩn lạc tổng số và dựa vào hình thái khuẩn lạc ựể xác ựịnh số loại, số lượng từng loại vi khuẩn. Thông qua việc phân loại CFU qua hình thái, kắch thước, màu sắc, dạng khuẩn lạc (S, M, R), ựếm số lượng từng loạị Sau ựó chọn những khuẩn lạc ựiển hình chuyển sang môi trường chuyên dụng ựề giám ựịnh vi khuẩn và làm kháng sinh ựồ.
* Cách nhận dạng các loại khuẩn lạc trong thạch thường.
- Ẹcoli khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn ướt, màu tro hay trắng nhạt, hơi lồị
- Salmonella sp: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, trong hoặc hơi xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữạ
- Staphylococus sp: khuẩn lạc dạng S, tròn bóng, rìa gọn, mặt lồi, có màu vàng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
* Cách nhận dạng các loại khuẩn lạc trong các môi trường chuyên dụng.
Sau khi tiến hành phân lập giám ựịnh các khuẩn lạc ựó bằng cách chọn các khuẩn lạc ựiển hình cho từng loại vi khuẩn cấy sang các môi trường chuyên dụng gồm:
- Môi trường thạch Mac Conkey:
+ Ẹcoli: hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen.
+ Salmonella sp: khuẩn lạc tròn, trong không màu, nhẵn bóng hơi lồi ở - Môi trường thạch Brrilliant Green Agar:
+ Ecoli: Khuẩn lạc Ẹcoli dạng S, màu vàng chanh.
+ Salmonella sp: Khuẩn lạc dạng S, màu hồng nhạt. - Môi trường Chapman: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Staphylococcus sp: khuẩn lạc to, rìa gọn, nếu là tụ cầu gây bệnh làm môi trường biến thành màu vàng, nếu là tụ cầu không gây bệnh, môi trường có màu ựỏ.
- Môi trường Edwards Medium:
Streptococcus sp: vi khuẩn mọc tốt, khuẩn lạc nhỏ, mịn, ướt, mặt hơi lồi, trong và sáng.
Từ môi trường chuyên dụng chúng tôi tiến hành ỘbắtỢ khuẩn lạc ựiển hình của Ẹcoli, Salmonella, Staphylococcus và Streptococcus, cấy chuyển vào môi trường nước thịt làm kháng sinh ựồ.
để thực hiện ựược các mục tiêu và nội dung nghiên cứu trên chúng tôi ựã bố trắ thắ nghiệm theo sơ ựồ saụ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Khuẩn lạc ựiển hình
Sơ ựồ 3.2: Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm
Mẫu phân Pha loãng nồng ựộ 10-x Kháng sinh ựồ Nước thịt 370C (18-24h) Khuẩn lạc thuần khiết Giữ giống Chapman (Staphylococus) Edwards (Streptococcus) BGA (Salmonella, Ẹcoli) MacConkey (Ẹcoli, Salmonella) Các môi trường chuyên dụng Số khuẩn lạc từng loại đếm tổng số khuẩn lạc (CFU) Thạch thường
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34