Như đã chỉ ra trong phần trước, khả năng ứng dụng của chitosan phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc, khối lượng phân tử và mức độ DD của nó. Các chế phẩm chitoan sau chiếu xạ tia gamma 60Co có khối lượng phân tử khác nhau, với sự phân bố khối lượng phân tử tương đối rộng, do sự cắt mạch của bức xạ là không đặc hiệu và có thể xảy ra tại bất kỳ liên kết 1-4 glucozit nào trong phân tử. Vì vậy, cần phải áp dụng kỹ thuật tách phân đoạn nhằm thu được các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử đồng đều trong khoảng hẹp đáp ứng yêu cầu
56
ứng dụng. Phương pháp này được thực hiện tại phòng thí nghiệm nghiên cứu Công nghệ Bức xạ tại Trung tâm chiếu xạ Hà nội.
Để tách các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử khác nhau, có thể áp dụng một số phương pháp như: kỹ thuật tách bằng sắc ký, kỹ thuật tách các phân đoạn polyme theo tính tan, sử dụng màng siêu lọc, kỹ thuật điện di, màng thẩm tách, hoặc các phương pháp kết hợp lọc-ly tâm, điện thẩm tách với màng siêu lọc... Phương pháp lọc - ly tâm để tách các phân đoạn là một trong các kỹ thuật hiện đại có thể áp dụng để tách các phân đoạn chitosan có phân bố khối lượng phân tử khá đồng đều (chỉ số đa phân tán Mw/Mn ~2, trong khi các nghiên cứu khác cho thấy chitosan chiếu xạ có phân bố khối lượng phân tử rất rộng Mw/Mn có thể lên đến 4-5 [56]). Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi tiêu tốn thời gian và nhân công nên chưa được phát triển ở Việt Nam.
Chitosan là một polyme chỉ hòa tan trong môi trường axit, do đó kết tủa và siêu lọc là phương pháp mang lại hiệu quả nhất. Tuy nhiên, phương pháp kết tủa yêu cầu phải sử dụng một số hệ dung môi khác nhau cho từng phân đoạn và khó có thể tách biệt chính xác theo khối lượng phân tử yêu cầu. Trong khi, kỹ thuật siêu lọc lại đòi hỏi phải sử dụng các loại màng lọc có kích thước nhất định. Trên quy mô phòng thí nghiệm hiện có, nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật siêu lọc với các dụng cụ lọc ly tâm Centrprep để tách các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử phân bố trong các khoảng hẹp, sử dụng màng có kích thước lỗ tương ứng với giới hạn khối lượng phân tử trung bình số (NMWL) 3, 5, 10, 30 và 50kDa. Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam áp dụng phương pháp lọc – ly tâm để tách các phân đoạn polyme có khối lượng phân tử khác nhau bằng màng siêu lọc.
a) Vật liệu và phương pháp
Vật liệu: Luận án đã kế thừa các chế phẩm chitosan sau chiếu xạ có khối lượng phân tử thích hợp từ đề tài nghiên cứu khoa học cấp nhà nước [11], sử dụng làm nguyên liệu để tách các phân đoạn chitosan có khối lượng phân tử khác nhau được thể hiện trên bảng 2.3.
Bảng 2.3: Các phân đoạn chitosan tách từ mẫu chitosan chiếu xạ tương ứng
STT Nguồn gốc MW sau chiếu xạ
1 CTS01-200 kGy (MW ≈ 6kDa)
2 CTS02-100 kGy (MW≈ 26kDa)
3 CTS02-200 kGy (MW≈ 16kDa)
4 CTS03-100 kGy (MW≈ 52kDa)
Hóa chất sử dụng: Ethanol (99,5%), axit Axetic (glacial)được cung cấp bởi công ty hóa chất DeaJung (Gyonggi, Hàn Quốc) vàsodium acetate potassium bromide, amonium acetate được cung gấp bởi hãng Merck (Đức).
b) Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: Các dụng cụ lọc ly tâm Centrprep được cung cấp bởi công ty Nihon Milipore Ltd, (Nhật Bản). Các loại dụng cụ lọc ly tâm được ký hiệu tương ứng với giới hạn khối lượng phân tử trung bình: YM 3, YM 10, YM 30, YM 50. Ống ly tâm có nắp khóa, màng siêu lọc có kích thước xác định có thể được dùng làm giàu, làm sạch, và khử muối cho các mẫu sinh học có thể tích từ 2 đến 15ml. Mặt khác, các dụng cụ này còn được sử dụng để
57
lọc và tách các polyme, đặc biệt là các polyme sinh học mà không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của chúng. Ống ly tâm siêu lọc này có tốc độ lọc cao tương đối dễ sử dụng và được thiết kế phù hợp với hầu hết các máy ly tâm có thể sử dụng ống ly tâm dung tích 50ml.
Hình 2.7 cho thấy dụng cụ siêu lọc Centriprep bao gồm: một ống chứa phần lọc có gắn màng xenlulo tái sinh Ultracel YM hút bám,phần chứa mẫu với nắp xoắn để khóa không cho mẫu dung dịch tràn ra, một nắp đậy kín khí để tách mẫu. Dụng cụ siêu lọc này cho phép quá trình lọc xảy ra đồng thời với việc lắng đọng các hạt mịn và không làm tắc màng lọc. Để hạn chế các mẫu được lọc đến khô hoàn toàn gây ảnh hưởng đến hoạt tính của chất tan, có một vòng chặn cỡ cố định gắn liền cung cấp thể tích mẫu làm giàu cuối cũng khoảng 0,6-0,7 ml.
Hình 2.7: Dụng cụ siêu lọc Centrprep - Thiết bị sử dụng:
+ Máy ly tâm Centrifuge (Hoa kỳ) với tốc độ quay tối đa 100.000 vòng / phút, gồm có hai hệ ống ly tâm với dung tích 15ml và 50ml.
+ Hệ sắc ký thẩm thấu GPC Agilent với phần mềm xử lý ASTRA và detector tán xạ ánh sáng, các detector độ nhớt và detector khúc xạ với chỉ số khúc xạ 1.331. Pha động là hỗn hợp dung môi gồm axit acetic 0,2M / sodium axetate 0,1M, với tốc độ dòng 1 ml/phút.
+ Máy sấy chân không Shellab (Anh quốc) gồm có bơm chân không với dải nhiệt độ hoạt động từ 30C đến 250C.
+ Thiết bị phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier (FTIR, Perkin Elmer Spectrum 2000, Anh quốc) với phần mềm xử lý phổ IR Spectrum 2.0.
*Phương pháp tách các phân đoạnchitosan sau chiếu xạ tia gamma Nắp kín khí
Nắp xoắn khóa
Vai thu gom chất lọc Rãnh thông
Phần gom chất lọc Giá đỡ màng lọc
Phần chứa mẫu
58 Các mẫu chế phẩm chitosan sau chiếu xạ tia gamma trên bảng 2.3 với nồng độ chitosan sử dụng 5% được hòa tan hoàn toàn trong axit axetic 0,2M trên máy khuấy từ thành dung dịch. Các dung dịch chitosan được cho vào ống ly tâm Centriprep gắn kèm màng siêu lọc có giới hạn khối lượng phân tử trung bình khác nhau. Trước tiên, 15ml dung dịch chitosan được đưa vào phần chứa mẫu của ống lọc YM-50 và đóng kín bằng nắp khóa. Bốn ống lọc giống nhau được đặt vào máy ly tâm, được ly tâm với tốc độ 20.000 vòng/ phút trong 20 phút. Tiếp theo, phần chất lọc chứa các phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình dưới 50kDa được gạn ra để riêng
cho mục đích tách tiếp theo. Phần mẫu còn lại được làm giàu như trên hình 2.8. Các dung dịch mẫu chitosan được đưa vào lọc với các ống lọc có giới hạn khối lượng phân tử giảm dần, nhằm thu được dung dịch có các phân đoạn chitosan khác nhau.
Các dung dịch phân đoạn chitosan sau ly tâm tách ra được tiếp tục làm giàu, sau đó được kết tủa trong ethanol, rửa sạch bằng nước cất, sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60C trong 24 giờ, cuối cùng thu được các mẫu chitosan phân đoạn. Các phân đoạn thu được từ các mẫu chitosan khác nhau được xác định, đánh giá hiệu quả của phương pháp tách siêu lọc dựa trên lượng mẫu bị thất thoát trong quá trình tách phân đoạn. Các phân đoạn chitosan được phân tích trên phổ hồng ngoại và sắc ký thẩm thấu GPC để xác định đặc tính phân tử của mẫu chitosan phân đoạn.
* Đặc trưng của các phân đoạn chitosan sau chiếu xạ
Các đặc tính phân tử của các mẫu chitosan phân đoạn được xác định bằng hệ sắc ký thẩm thấu (GPC-SEC, Agilent, Hoa Kỳ) trang bị các detector độ nhớt, tán xạ ánh sáng, tử ngoại và khúc xạ với chỉ số khúc xạ 1.331. Mẫu chitosan phân đoạn được hòa tan trong dung môi hỗn hợp gồm natri axetat 0,1M và axit acetic 0,2M thành dung dịch có nồng độ 2mg/ml, lọc qua màng lọc kích thước 0,22m trước khi bơm vào sắc ký. Hỗn hợp dung môi này cũng được sử dụng làm pha động trong quá trình chạy sắc ký, tốc độ dòng được đặt là 1ml/phút cho tất cả các mẫu phân tích. Phân bố khối lượng phân tử của chitosan được ghi lại trên sắc đồ, và được xử lý bằng phần mềm phân tích phổ ASTRA để xác định khối lượng phân tử trung bình và chỉ số đa phân tán của nó. Sắc đồ cũng chỉ rõ phân bố khối lượng phân tử của mẫu đo.
Cấu trúc phân tử của chitosan phân đoạn cũng được kiểm chứng phân tích bằng phổ hồng ngoại chuyển hóa Furrier (FTIR). Mẫu chitosan phân đoạn sau khi sấy khô được trộn đều với KBr, sau đó được ép thành mẫu có dạng đĩa mỏng. Mẫu được đặt vào giá để mẫu, đo phổ hồng ngoại FTIR sau khi đã loại bỏ nhiễu tín hiệu gây ra do không khí. Diện tích các đỉnh phổ tại bước sóng 3450 và 1650 cm-1được tính toán bằng phần mềm phân tích phổ FTIR Spectrum 2.0. Mức độ deacetyl hóa của mẫu được tính theo công thức (2.2) mục (2.3.1.1).
Khả năng tan của các phân đoạn chitosan được xác định thông qua thời gian hòa tan tính theo phút của 1g mẫu chitosan trong 100ml nước hoặc các dung dịch axit axetic loãng.
Hình 2.8: Tách chất tan với màng lọc Đường định cỡ
Nắp kín khí
59
2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu sử dụng chitosan công nghiệp Việt Nam và các chế phẩm chitosan sau chiếu xạ từ chúng trong xử lý kháng khuẩn cho vải bông
2.3.2.1 Quá trình thực nghiệm tạo mẫu vải kháng khuẩn và mẫu vải kháng khuẩn sau các lần giặt