Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của các chế phẩm, chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp các phương pháp gồm:
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
- Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm.
2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc
Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng (MS) và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.
2.4. Phương pháp định lượng
2.4.1. Các loại mẫu dùng nghiên cứu định lượng Hypophyllanthin - Mẫu 01: VRXOGA-PV - Công ty cổ phần dược phẩm Phúc Vinh. + Công dụng:
Hỗ trợ giải độc gan. Tăng cường chức năng gan, tăng sức đề kháng, hỗ trợ điều trị các bệnh về gan.
Hỗ trợ điều trị rối loạn chức năng gan: Hạ men gan, vàng da, chán ăn, mệt mỏi, ăn uống khó tiêu, dị ứng, mẫn ngứa.
+ Đối tượng sử dụng:
Dành cho người mắc bệnh về gan như: viêm gan virus, viêm gan B, rối loạn chức năng gan, men gan cao, xơ gan, gan nhiễm mỡ, vàng da, chán ăn, mệt mỏi, ăn uống khó tiêu, người uống nhiều bia rượu, ngộ độc thức ăn, hóa chất. + Thành phần:
Diệp hạ châu ...2000mg Chi tử ...1000mg Linh chi ...500mg Đại hoàng ...400mg Actiso ...1500mg Nhân trần ...1500mg Rau má ...1000mg Và các thành phần khác.
Khối lượng trung bình 1 viên: 1,2947g/viên. + Số lô SX: 010513.
+ Ngày sản xuất: 240513. + Hạn sử dụng: 230516.
- Mẫu 02: Diệp Hạ Châu BPV- Công ty cổ phần BV PHARMA.
Chai 100 viên nén bao phim. Khối lượng trung bình 1 viên 0,328g. + Thành phần mỗi viên nén bao phim: Cao khô diệp hạ châu 250mg.
+ Điều trị: Viêm gan cấp và mãn tính, tăng men gan, suy yếu chức năng gan, vàng da, ăn khó tiêu, bí đại tiểu tiện, táo bón. Tiêu độc trong các trường hợp viêm họng, mụn nhọt, lở ngứa do chức năng gan kém. Viêm thận, sỏi đường tiết niệu viêm ruột, tiêu chảy..
+ Số lô SX: 12G13. + HD: 180716.
- Mẫu 03: Diệp Hạ Châu: công ty cổ phần dược DANAPHA.
+ Công dụng: Tăng cường chức năng gan, phục hồi tế bào gan. Điều trị hỗ trợ viêm gan, đau yết hầu, ung nhọt, lỡ ngứa.
+ Ngày SX: 140114. +Số lô SX: 091213. + Hạn Dùng: 140117.
+ Thành phần cho 1 viên( khối lượng trung bình 0,34417g/viên): Diệp hạ châu đắng... 250mg. Tá dược vừa đủ 1 viên.
- Mẫu 04: Chancapiedra Diệp Hạ Châu: Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam.
+ thành phần 1 viên( khối lượng trung bình 0,7071g):
Cao khô diệp hạ châu ...200mg Cao khô biển súc...100mg Cao khô bồ công anh...50 mg Cao khô nhọ nồi ...50 mg Cao khô rau má ...25mg Tá dược vừa đủ 1 viên.
+ Công dụng: Giúp thanh nhiệt, giải độc, tăng cường chức năng gan. Hỗ trợ điều trị rối loạn chức năng gan, dị ứng, mẫn ngứa, viêm gan mãn tính.
+ Lô SX: 010514. + NSX: 150514. +HSD: 150517.
- Mẫu 05: Diệp Hạ Châu V: Công ty TNHH Vạn Xuân. Khối lượng trung bình 1 viên nang là 0,56555g.
+ Thành phần: Lá khô diệp hạ châu ...0,20g. Cao khô diệp hạ châu toàn cây ...0,25g.
+ Công dụng: Thanh can, lợi mật, nhuận trường, lợi tiểu, tiêu độc, thông huyết mạch.
+ Điều trị: Chứng thấp nhiệt( nóng trong người, chán ăn, tiểu vàng, tiểu ít, mụn nhọt...) viêm gan cấp và mãn tính, ngộ độc, ...
+ Lô SX: 051213. +NSX:30.12.2013. + HD: 30.12.2015.
- Mẫu 06: Diệp Hạ Châu Phylanthus unirania: công ty cổ phần dược phẩm 2/9- NADYPHAR. Chai 60 viên nang. khối lượng trung bình 0,5566g/viên. + Công thức: Diệp hạ châu 3g. Tá dược vừa đủ 1 viên nang.
+ Chỉ định: Chứng do viêm nhiễm, viêm da thần kinh, viêm cầu thận, viêm ruột, viêm gan, đau yết hầu, đinh râu, mụn nhọt, lữa ngứa, sỏi đường tiết niệu,...
+ Số lo SX: 0010414A. + NSX: 070414.
+HD: 070417.
- Mẫu 07: L’ANGFARM Diệp hạ châu sấy khô- đặc sản Đà Lạt, 225gr- Công ty TNHH Quảng Thái.
+ Công dụng: Có vị đắng, hơi ngọt, tính mát, có tác dụng thanh Can lương huyết, lợi tiểu, sát trùng, giải độc, điều trị sỏi thận, sỏi mật và viêm gan siêu vi B.
Hình 2.1: Mẫu 01(M1). Hình 2.2: Mẫu 02(M2). Hình 2.3: Mẫu 03 (M3).
Hình 2.6: Mẫu 06(M6). Hình 2.7: Mẫu 07(M7).
2.4.2. Phương pháp chuẫn bị mẫu:
2.4.2.1. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc chất chuẩn(Hypophyllanthin) (Hypophyllanthin)
Phần trên mặt đất cây chó đẻ (2,0kg), được phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày). Dịch chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao metanol (102g). Phân bố cao metanol trong nước, sau đó lắc lần lượt với cloroform, n-butanol, cất thu hồi dung môi thu được cao là 55g và 15g, tương ứng.
Cao cloroform được phân tách bằng sắc ký cột nhồi silicagel, dung môi giải hấp là cloroform:metanol (99: 1: 40:1; 30:1; 20:1) thu được 10 phân đoạn chính. Phân đoạn 4 tinh chế lại bằng sắc ký cột thu được hợp chất 1 (1092mg).
Hợp chất 1: Tinh thể hình kim dài, đ.n.c. 137-1380C. ESI-MS m/z: 431 [M+H]+; 1H-NMR và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): xem bảng 3.1.
2.4.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn hypophyllanthin cho phép đo HPLC
- Chuẫn bị pha động
+ Cân 100mg chất chuẩn (phân lập, tinh chế và xác định ở mục 2.4.2.1) cho vào bình định mức 100 ml, đánh siêu âm để chất chuẩn hòa tan hoàn toàn vào dung môi sau đó lọc qua giấy lọc ta được các dung dịch chuẩn 1000ppm, pha loãng được dung dịch trung gian 100ppm.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ lần lượt là 0,5ppm; 1ppm; 2ppm; 5ppm; 10ppm; 50ppm: hút dung dịch trung gian đã được pha ở trên, pha trong vừa đủ dung môi theo bảng 2.1 sau để có dãy chuẩn S1. Dãy này để khảo sát độ lặp lại, độ tuyến tính và được dùng làm đường chuẩn để định lượng.
Bảng 2.1 Cách pha các dung dịch chuẩn:
C1 C2 C3 C4 C5 C6 Số ml chuẩn trung gian 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0 Định mức vừa đủ dung dịch pha động (ml) 10 10 10 10 10 10 Nồng dộ (ppm) 0,5ppm 1,0ppm 2,0ppm 5,0ppm 10ppm 50ppm
2.4.2.3. Chuẩn bị mẫu thử chế phẩm và cách tiến hành:
Cân chính xác một lượng bột chế phẩm sau khi đã được nghiền nhỏ( từ 1-1,5g), thêm tiếp 2,5ml nước siêu sạch và 300mg CaO vào và lắc đều, thu được hỗn hợp 1. Hỗn hợp 1 thu được đem siêu âm gia nhiệt trong 8 giờ, thu được dịch chiết. Thêm vào dịch chiết một lượng KOH (khoảng bằng 30% khối lượng mẫu chế phẩm), thêm tiếp 30ml dung môi ACN thu được hỗn hợp 2. Đun hồi lưu hỗn hợp 2 trong 60 phút, rồi tiến hành lọc, thu được bã rắn và
dung dịch 1. Bã rắn thu được, tiếp tục thêm KOH và dung môi ACN vào và tiến hành lặp lại quá trình như dịch chiết thu được ở trên, thu được dung dịch 2. Gộp dung dịch 1 và dung dịch 2 thu được dung dịch 3. Cô quay thu hồi dung môi áp suất thấp dung dịch 3 và định mức bằng dung môi MeOH:ACN theo tỉ lệ 85:15(về thể tích) trong bình định mức 50ml. Sau đó, lọc qua màng 0,45μm, rồi bơm vào HPLC.
Quá trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ sau: 1g thuốc 2,5ml H2O 300mg CaO Hỗn hợp 1 Dịch siêu âm KOH 30ml ACN Hỗn hợp 2 Đun hồi lưu
60phút Lọc Dung dịch 1 Bã rắn 30ml ACN KOH Hỗn hợp Đun hồi lưu 60phút Lọc Dung dịch 2 Dung dịch 3 50ml mẫu HPLC
Cô quay thu hồi dung môi áp suất thấp Siêu âm gia nhiệt
trong 8 giờ
Định mức bằng MeOH:ACN
Màng Lọc 0,45μm
2.4.2.4. Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký : Cột pha đảo RP 18 (150 x 4,6 mm, 5 μm). - Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng (30oC).
- Pha động : MeOH : ACN (85 : 15 v/v ). Đánh siêu âm đến hết bọt trước khi sử dụng. - Thể tích tiêm mẫu : 10μl.
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút.
- Bước sóng đầu dò UV đo ở 230nm. - Áp suất 73 bar.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc chất hypophyllanthin:
Phổ khối lượng EI của hợp chất 1 cho pic ion m/z 431[M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C24H30O7. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 5 nhóm OCH3 ở δ 3,21 (s), 3,25(s), 3,70 (s), 3,70 (s) và 3,78 (s) ppm, 5 tín hiệu proton thơm 6,63 (d, 2,0, H-2’), 6,80 (d, 8,0, H-5), 6,45 (s, H-5’), 6,65 (dd, 8,5, 2,0, H-6’). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu tương ứng của 24 cacbon.
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1.
Bảng 3.1: Số liệu NMR của hợp chất 1 Vị trí
1H-NMR 13C-NMR
Thực nghiệm Tài liệu [3] Thực
nghiệm Tài liệu
1 3,95 (d, 7,5) 4,07 (d, 7,8) 41,1 41,9 1’ 137,9 138,1 2 1,77 m 1,87 m 44,7 45,4 2’ 6,63 (d, 2,0) 6,65 (d, 2,0) 112,1 111,9 2a 3,16 3,29 3,22 (dd, 9,6, 3,5) 3,44 (dd, 9,6, 1,0) 71,6 71,8 2a-OCH3 3,21 (s) 3,29 (s) 58,4 58,9 3 1,85m 1,94m 36,6 35,9 3’ 148,3 148,6 3’-OCH3 3,67 (s) 3,78 (s) 55,4 55,8 3a 3,18 3,27 3,36 (dd, 9,6, 6,2) 3,41 (dd, 9,6, 4,2) 74,7 77,5 3a-OCH3 3,25(s) 3,31 (s) 58,3 58,9 4β 2,78 (dd, 16,0,4,5) 2,79 (dd, 15,9, 5,4) 4α 2,61 (dd,15,5, 11,0) 2,71 (dd, 15,9, 10,8) 32,7 33,3 4’ 147,0 147,1 4’-OCH3 3,70 (s) 3,82 (s) 55,5 55,9 4a 131,7 131,8 5 6,45 (s) 6,31 (s) 106,7 106,5 5’ 6,80 (d, 8,0) 6,72 (d, 8,0) 111,6 110,7 6 141,7 142,1 6’ 6,65 (dd, 8,5, 2,0) 6,62 (dd, 8,0, 2,0) 119,9 120,4 6-OCH3 3, 78 (s) 3,85 (s) 56,1 56,4 7 132,8 133,3 8 146,5 147,0 8a 114,5 115,1 O-CH2-O 5,69 5,63 (d,1,4) 100,6 101,1
5,71 5,71 (d,1,4)
Qua số liệu phổ và so sánh với tài liệu có thể kết luận chất 1 là một hợp chất lignan, có tên là hypophyllanthin. Hợp chất này đã được phân lập từ cây
Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria, có hoạt tính kháng virut viêm gan B mạnh.
3.2. Xác định và định lượng hypophyllanthin
3.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của hypophyllanthin
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,5ppm; 1ppm; 2 ppm; 5ppm; 10ppm; 50ppm. Sau đó tiến hành đo sắc ký với các thông số như mục 2.4.2.3, Ghi các sắc đồ như hình 3.4- hình 3.9. Xác định diện tích píc hypophyllanthin trong từng dung dịch chuẩn, kết quả thể hiện ở bảng 3.2. Xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ dung dịch chuẩn, kết quả thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 1 ppm.
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 5 ppm.
Hình 3.9: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 50ppm.
Bảng 3.2: Diện tích píc của hypophyllanthin tương ứng với từng nồng độ chuẩn TT Nồng độ chuẩn ppm Diện tích píc 1 0,5 11,79967 4 1 23,56700 2 2 47,05600 3 5 114,9500 5 10 227,62 6 50 1163,6382
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.2, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ ta có đường chuẩn của Hypophyllanthin như sau:
Phương trình đường chuẩn hypophyllanthin có dạng: y= 23,27154x – 0,781347.
Hình 3.10: Đường chuẩn hypophyllanthin.
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương phápphân tích phân tích
3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
3*SD LOD
a
=
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu coi là độ lệch chuẫn của các phép đo lặp lại của dung dịch có nồng độ nhỏ.
Tiến hành đo lặp lại 10 lần xác định diện tích píc của dung dịch chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 0,5 ppm, kết quả đo được và tính toán thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả tính độ lệch chuẩn 10 phép đo lặp lại xác định diện tích píc của hypophyllanthin Lần đo (dung dịch chuẩn Hypophyllanthin 0,5ppm) Diện tích píc Nồng độ(ppm) 1 11.79967 0.540618 2 12.18857 0.55733 3 11.97341 0.548084 4 11.94625 0.546917 5 12.00318 0.549363 6 12.18114 0.55701 7 12.21524 0.558476 8 12.10613 0.553787 9 11.93209 0.546308 10 11.9712 0.547989 Trung bình 12.032 0.551 SD 0.00485
Giá trị LOD của chuẩn hypophyllanthin :
3* 3*0.00485 23.27154 SD LOD a = = = 0.000625(ppm)= 0,625 (ppb).
3.2.2.2. Giới hạn định lượng LOQ
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qủa có độ chụm mong muốn.
LOQ= 3,3 X LOD = 0,00206 ppm =2,06 ppb
3.2.3. Kết quả phân tích hypophyllanthin trong các mẫu chế phẩm
Qua số liệu LOD và LOQ ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát hiện và khoảng giới hạn định lượng rất nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, có
thể phát hiện được hàm lượng hypophyllanthin dưới dạng vết có trong mẫu phân tích.
Hàm lượng hypophyllanthin (μg/ml) có trong mẫu chế phẩm được tính dựa vào đường chuẩn như sau:
0 0,78135 23, 27154 tb S C = +
Nồng độ hypophyllanthin trong 1 viên chế phẩm (mg/viên) được tính theo công thức: 0 1 1 .50. vien vien thu C m C m = .10-3
Trong đó: C1vien là hàm lượng hypophyllanthin có trong 1 viên mẫu (mg/viên). C0 là hàm lượng hypophyllanthin có trong dịch chiết thông qua đường chuẩn, ppm.
Stb là diện tích píc trung bình thu được của mẫu thử. mthu là khối lượng mẫu thử (g).
m1vien là khối lượng trung bình 1 viên mẫu thử (g). 50 là thể tích bình định mức mẫu (ml).
10-3 quy đổi từ 1μg = 10-3 mg.
Xử lí các mẫu chế phẩm theo quy trình ở mục 2.4.2.3, sử dụng các thông số đo sắc kí như ở mục 2.4.2.4, tiến hành ghi sắc kí đồ, xác định diện tích píc và tính toán thu được kết quả trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả phân tích hàm lượng trung bình của hypophyllanthin trong các mẫu
Mẫu C0(μg/ml) Khối lượng (g) Diện tích píck C1g (mg/1g) C1vien (mg/1viên) M1 18.488 1.2947 429.473 0,7140 0,9244
M2 24.381 1.312 566.612 0,9292 0,3048 M3 13.172 1.0325 305.745 0,6379 0,2195 M4 31.137 1.4142 723.827 1,10087 0,7784 M5 30.39 1.1311 706.504 1,3434 0,7598 M6 39.91 1.1131 927.976 1,7927 0,9978 M7 207.108 1.0028 4818.941 10,3265
3.2.4. Đánh giá phương pháp xác định hypophyllanthin 3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Theo lý thuyết thống kê, các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hoặc hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn. n là số lần thí nghiệm.
Xi là giá trị tính được của lần thực hiện thứ i. là giá trị trung bình của các lần thực hiện.
Tiến hành xác định độ lặp lại trên các mẫu chế phẩm, bằng cách đo lặp lại, xác định diện tích píc của mỗi loại chế phẩm. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu chế phẩm
m(g) (1viên) C (mg/1viên) m(g) (4viên) C (mg/1viên) m(g) (3viên) C (mg/1viên) 1 1.2947 0.9003 1.312 0.2888 1.0325 0.216 2 1.2947 0.9444 1.312 0.3047 1.0325 0.2243 3 1.2947 0.9271 1.312 0.3274 1.0325 0.2219 4 1.2947 0.9248 1.312 0.3088 1.0325 0.2188 5 1.2947 0.9256 1.312 0.2942 1.0325 0.2166 Xtb 0.924 0.305 0.220 SD 0,0157 0.015 0.0035 CV(%) 1.7035 4.9059 1.6061 Lần M4 M5 m (g) ( 2 viên) C (mg/1viên) m (g) (2 viên) C (mg/1viên) 1 1.4142 0.764 1.1311 0.7687 2 1.4142 0.783 1.1311 0.7617 3 1.4142 0.785 1.1311 0.7566 4 1.4142 0.7682 1.1311 0.7581 5 1.4142 0.7919 1.1311 0.7538 Xtb 0.778 0.760 SD 0.0118 0.0057 CV(%) 1.5170 0.7549
Lần M6 M7 m(g) (2 viên) C(mg/1viên) m (g) C (mg/1g) 1 1.1131 1.0228 1.0028 10.355 2 1.1131 0.9734 1.0028 10.372 3 1.1131 0.9796 1.0028 10.38 4 1.1131 0.9949 1.0028 10.295 5 1.1131 1.0179 1.0028 10.377 Xtb 0.998 10.355 SD 0.0222 0.0315 CV(%) 2.2236 0.3046