a. Phương pháp đường chuẩn
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phương trình cơ bản của phép đo A = k.C và một dãy mẫu đầu (ít nhất 3 mẫu đầu) để dựng một đường chuẩn, sau đó nhờ vào đường chuẩn này và giá trị Ax để xác định nồng độ Cx
của chất cần phân tích trong mẫu đo sắc ký, rồi từ đó tính được nồng độ của nó trong mẫu phân tích.
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy mẫu đầu có nồng độ của chất X cần xác định là C1, C2, C3, C4, C5 và các mẫu phân tích có nồng độ Cx1, Cx2... Sau đó chọn các điều kiện phù hợp và đo nồng độ của chất cần phân tích trong tất cả các mẫu đầu và mẫu phân tích ta thu được các giá trị tương ứng A1, A2, A3, Ax1, Ax2... và lập đồ thị chuẩn A=f(C).
Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và rất thích hợp với việc phân tích hàng loạt mẫu của cùng một chất. Khi mẫu phân tích có thành phần phức tạp và chúng ta chưa biết chính xác thì không thể chuẩn bị được một dãy mẫu đầu đúng nên sẽ bị ảnh hưởng của nền, thành phần của mẫu.
b. Phương pháp nội chuẩn
Người ta thêm vào mẫu (có khối lượng cố định là E) một lượng xác định mr của chất đã được chọn làm chất nội chuẩn.
Chất nội chuẩn có thể là một chất lạ hoặc cũng có thể là một cấu tử nào đó có sẵn trên sắc đồ. Nếu là chất lạ thì thời gian lưu của nó phải gần thời gian lưu của cấu tử cần được phân tích định lượng. Hàm lượng của cấu tử cần xác định đó được tính như sau:
Trong trường hợp sắc đồ không còn chỗ hở cho việc đưa thêm chất nội chuẩn vào nữa, người ta áp dụng phương pháp nội chuẩn, tức là chuẩn bằng chính cấu tử cần xác định. Người ta thêm vào hỗn hợp mẫu (có khối lượng ban đầu E) một lượng cấu tử i đã biết là mi. Sau đó người ta so sánh píc của cấu tử I đó giữa hai sắc đồ trước và sau khi cho thêm chất nội chuẩn (Ai1 và Ai2). Mặt khác người ta cũng so sánh sự thay đổi của một diện tích píc của cấu tử x khác (Ax1 và Ax2).
Hàm lượng phần trăm khối lượng của cấu tử i cần xác định sẽ là:
Trong trường hợp này người ta không cần đến hệ số f nữa và đồng thời cũng không nhất thiết phải có kỹ thuật bơm lặp lại như phương pháp ngoại chuẩn. Phương pháp này còn gọi là phương pháp thêm chuẩn.
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
- Cân phân tích có độ chính xác 0,01 mg. - Cân kỹ thuật độ chính xác 0,1 g.
- Bộ dụng cụ đun hồi lưu.
- Các dụng cụ thủy tinh chính xác( bình định mức, pipet, bình tam giác, ...)
- Thiết bị lọc : Màng lọc 13mm, 0.45 μm (PTFE)
- Hệ thống máy HPLC kết nối với đầu dò UV bước sóng 230nm, Agilent 1100.
- Cột sắc ký pha đảo RP18 (150 x 4.6mm, 5μm) .
- - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY được đo trên máy Bruker 125 MHz.
2.2. Hóa chất và chất chuẩn
Hóa chất sử dụng là loại tinh khiết PA.
- Chất chuẩn Hypophyllanthin (phân lập, tinh chế ở mục 2.4.2.1).
- Dung dịch chuẩn làm việc Hypophyllanthin nồng độ lần lượt là 0,5ppm; 1ppm; 2ppm; 5ppm; 10ppm; 50ppm.
- Dung môi methanol (Merk).
- Dung môi acetonitrile (ACN) (Merk) - Kalihydroxyt.
- Nước cất 2 lần khử ion.
- Các chế phẩm có chứa Hypophyllanthin . - Cloroform, n-butanol, Hexan, axeton.
2.3. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc2.3.1. Phương pháp phân lập 2.3.1. Phương pháp phân lập
Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của các chế phẩm, chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp các phương pháp gồm:
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
- Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm.
2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc
Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng (MS) và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.
2.4. Phương pháp định lượng
2.4.1. Các loại mẫu dùng nghiên cứu định lượng Hypophyllanthin - Mẫu 01: VRXOGA-PV - Công ty cổ phần dược phẩm Phúc Vinh. + Công dụng:
Hỗ trợ giải độc gan. Tăng cường chức năng gan, tăng sức đề kháng, hỗ trợ điều trị các bệnh về gan.
Hỗ trợ điều trị rối loạn chức năng gan: Hạ men gan, vàng da, chán ăn, mệt mỏi, ăn uống khó tiêu, dị ứng, mẫn ngứa.
+ Đối tượng sử dụng:
Dành cho người mắc bệnh về gan như: viêm gan virus, viêm gan B, rối loạn chức năng gan, men gan cao, xơ gan, gan nhiễm mỡ, vàng da, chán ăn, mệt mỏi, ăn uống khó tiêu, người uống nhiều bia rượu, ngộ độc thức ăn, hóa chất. + Thành phần:
Diệp hạ châu ...2000mg Chi tử ...1000mg Linh chi ...500mg Đại hoàng ...400mg Actiso ...1500mg Nhân trần ...1500mg Rau má ...1000mg Và các thành phần khác.
Khối lượng trung bình 1 viên: 1,2947g/viên. + Số lô SX: 010513.
+ Ngày sản xuất: 240513. + Hạn sử dụng: 230516.
- Mẫu 02: Diệp Hạ Châu BPV- Công ty cổ phần BV PHARMA.
Chai 100 viên nén bao phim. Khối lượng trung bình 1 viên 0,328g. + Thành phần mỗi viên nén bao phim: Cao khô diệp hạ châu 250mg.
+ Điều trị: Viêm gan cấp và mãn tính, tăng men gan, suy yếu chức năng gan, vàng da, ăn khó tiêu, bí đại tiểu tiện, táo bón. Tiêu độc trong các trường hợp viêm họng, mụn nhọt, lở ngứa do chức năng gan kém. Viêm thận, sỏi đường tiết niệu viêm ruột, tiêu chảy..
+ Số lô SX: 12G13. + HD: 180716.
- Mẫu 03: Diệp Hạ Châu: công ty cổ phần dược DANAPHA.
+ Công dụng: Tăng cường chức năng gan, phục hồi tế bào gan. Điều trị hỗ trợ viêm gan, đau yết hầu, ung nhọt, lỡ ngứa.
+ Ngày SX: 140114. +Số lô SX: 091213. + Hạn Dùng: 140117.
+ Thành phần cho 1 viên( khối lượng trung bình 0,34417g/viên): Diệp hạ châu đắng... 250mg. Tá dược vừa đủ 1 viên.
- Mẫu 04: Chancapiedra Diệp Hạ Châu: Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam.
+ thành phần 1 viên( khối lượng trung bình 0,7071g):
Cao khô diệp hạ châu ...200mg Cao khô biển súc...100mg Cao khô bồ công anh...50 mg Cao khô nhọ nồi ...50 mg Cao khô rau má ...25mg Tá dược vừa đủ 1 viên.
+ Công dụng: Giúp thanh nhiệt, giải độc, tăng cường chức năng gan. Hỗ trợ điều trị rối loạn chức năng gan, dị ứng, mẫn ngứa, viêm gan mãn tính.
+ Lô SX: 010514. + NSX: 150514. +HSD: 150517.
- Mẫu 05: Diệp Hạ Châu V: Công ty TNHH Vạn Xuân. Khối lượng trung bình 1 viên nang là 0,56555g.
+ Thành phần: Lá khô diệp hạ châu ...0,20g. Cao khô diệp hạ châu toàn cây ...0,25g.
+ Công dụng: Thanh can, lợi mật, nhuận trường, lợi tiểu, tiêu độc, thông huyết mạch.
+ Điều trị: Chứng thấp nhiệt( nóng trong người, chán ăn, tiểu vàng, tiểu ít, mụn nhọt...) viêm gan cấp và mãn tính, ngộ độc, ...
+ Lô SX: 051213. +NSX:30.12.2013. + HD: 30.12.2015.
- Mẫu 06: Diệp Hạ Châu Phylanthus unirania: công ty cổ phần dược phẩm 2/9- NADYPHAR. Chai 60 viên nang. khối lượng trung bình 0,5566g/viên. + Công thức: Diệp hạ châu 3g. Tá dược vừa đủ 1 viên nang.
+ Chỉ định: Chứng do viêm nhiễm, viêm da thần kinh, viêm cầu thận, viêm ruột, viêm gan, đau yết hầu, đinh râu, mụn nhọt, lữa ngứa, sỏi đường tiết niệu,...
+ Số lo SX: 0010414A. + NSX: 070414.
+HD: 070417.
- Mẫu 07: L’ANGFARM Diệp hạ châu sấy khô- đặc sản Đà Lạt, 225gr- Công ty TNHH Quảng Thái.
+ Công dụng: Có vị đắng, hơi ngọt, tính mát, có tác dụng thanh Can lương huyết, lợi tiểu, sát trùng, giải độc, điều trị sỏi thận, sỏi mật và viêm gan siêu vi B.
Hình 2.1: Mẫu 01(M1). Hình 2.2: Mẫu 02(M2). Hình 2.3: Mẫu 03 (M3).
Hình 2.6: Mẫu 06(M6). Hình 2.7: Mẫu 07(M7).
2.4.2. Phương pháp chuẫn bị mẫu:
2.4.2.1. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc chất chuẩn(Hypophyllanthin) (Hypophyllanthin)
Phần trên mặt đất cây chó đẻ (2,0kg), được phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày). Dịch chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao metanol (102g). Phân bố cao metanol trong nước, sau đó lắc lần lượt với cloroform, n-butanol, cất thu hồi dung môi thu được cao là 55g và 15g, tương ứng.
Cao cloroform được phân tách bằng sắc ký cột nhồi silicagel, dung môi giải hấp là cloroform:metanol (99: 1: 40:1; 30:1; 20:1) thu được 10 phân đoạn chính. Phân đoạn 4 tinh chế lại bằng sắc ký cột thu được hợp chất 1 (1092mg).
Hợp chất 1: Tinh thể hình kim dài, đ.n.c. 137-1380C. ESI-MS m/z: 431 [M+H]+; 1H-NMR và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): xem bảng 3.1.
2.4.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn hypophyllanthin cho phép đo HPLC
- Chuẫn bị pha động
+ Cân 100mg chất chuẩn (phân lập, tinh chế và xác định ở mục 2.4.2.1) cho vào bình định mức 100 ml, đánh siêu âm để chất chuẩn hòa tan hoàn toàn vào dung môi sau đó lọc qua giấy lọc ta được các dung dịch chuẩn 1000ppm, pha loãng được dung dịch trung gian 100ppm.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ lần lượt là 0,5ppm; 1ppm; 2ppm; 5ppm; 10ppm; 50ppm: hút dung dịch trung gian đã được pha ở trên, pha trong vừa đủ dung môi theo bảng 2.1 sau để có dãy chuẩn S1. Dãy này để khảo sát độ lặp lại, độ tuyến tính và được dùng làm đường chuẩn để định lượng.
Bảng 2.1 Cách pha các dung dịch chuẩn:
C1 C2 C3 C4 C5 C6 Số ml chuẩn trung gian 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0 Định mức vừa đủ dung dịch pha động (ml) 10 10 10 10 10 10 Nồng dộ (ppm) 0,5ppm 1,0ppm 2,0ppm 5,0ppm 10ppm 50ppm
2.4.2.3. Chuẩn bị mẫu thử chế phẩm và cách tiến hành:
Cân chính xác một lượng bột chế phẩm sau khi đã được nghiền nhỏ( từ 1-1,5g), thêm tiếp 2,5ml nước siêu sạch và 300mg CaO vào và lắc đều, thu được hỗn hợp 1. Hỗn hợp 1 thu được đem siêu âm gia nhiệt trong 8 giờ, thu được dịch chiết. Thêm vào dịch chiết một lượng KOH (khoảng bằng 30% khối lượng mẫu chế phẩm), thêm tiếp 30ml dung môi ACN thu được hỗn hợp 2. Đun hồi lưu hỗn hợp 2 trong 60 phút, rồi tiến hành lọc, thu được bã rắn và
dung dịch 1. Bã rắn thu được, tiếp tục thêm KOH và dung môi ACN vào và tiến hành lặp lại quá trình như dịch chiết thu được ở trên, thu được dung dịch 2. Gộp dung dịch 1 và dung dịch 2 thu được dung dịch 3. Cô quay thu hồi dung môi áp suất thấp dung dịch 3 và định mức bằng dung môi MeOH:ACN theo tỉ lệ 85:15(về thể tích) trong bình định mức 50ml. Sau đó, lọc qua màng 0,45μm, rồi bơm vào HPLC.
Quá trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ sau: 1g thuốc 2,5ml H2O 300mg CaO Hỗn hợp 1 Dịch siêu âm KOH 30ml ACN Hỗn hợp 2 Đun hồi lưu
60phút Lọc Dung dịch 1 Bã rắn 30ml ACN KOH Hỗn hợp Đun hồi lưu 60phút Lọc Dung dịch 2 Dung dịch 3 50ml mẫu HPLC
Cô quay thu hồi dung môi áp suất thấp Siêu âm gia nhiệt
trong 8 giờ
Định mức bằng MeOH:ACN
Màng Lọc 0,45μm
2.4.2.4. Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký : Cột pha đảo RP 18 (150 x 4,6 mm, 5 μm). - Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng (30oC).
- Pha động : MeOH : ACN (85 : 15 v/v ). Đánh siêu âm đến hết bọt trước khi sử dụng. - Thể tích tiêm mẫu : 10μl.
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút.
- Bước sóng đầu dò UV đo ở 230nm. - Áp suất 73 bar.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc chất hypophyllanthin:
Phổ khối lượng EI của hợp chất 1 cho pic ion m/z 431[M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C24H30O7. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 5 nhóm OCH3 ở δ 3,21 (s), 3,25(s), 3,70 (s), 3,70 (s) và 3,78 (s) ppm, 5 tín hiệu proton thơm 6,63 (d, 2,0, H-2’), 6,80 (d, 8,0, H-5), 6,45 (s, H-5’), 6,65 (dd, 8,5, 2,0, H-6’). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu tương ứng của 24 cacbon.
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1.
Bảng 3.1: Số liệu NMR của hợp chất 1 Vị trí
1H-NMR 13C-NMR
Thực nghiệm Tài liệu [3] Thực
nghiệm Tài liệu
1 3,95 (d, 7,5) 4,07 (d, 7,8) 41,1 41,9 1’ 137,9 138,1 2 1,77 m 1,87 m 44,7 45,4 2’ 6,63 (d, 2,0) 6,65 (d, 2,0) 112,1 111,9 2a 3,16 3,29 3,22 (dd, 9,6, 3,5) 3,44 (dd, 9,6, 1,0) 71,6 71,8 2a-OCH3 3,21 (s) 3,29 (s) 58,4 58,9 3 1,85m 1,94m 36,6 35,9 3’ 148,3 148,6 3’-OCH3 3,67 (s) 3,78 (s) 55,4 55,8 3a 3,18 3,27 3,36 (dd, 9,6, 6,2) 3,41 (dd, 9,6, 4,2) 74,7 77,5 3a-OCH3 3,25(s) 3,31 (s) 58,3 58,9 4β 2,78 (dd, 16,0,4,5) 2,79 (dd, 15,9, 5,4) 4α 2,61 (dd,15,5, 11,0) 2,71 (dd, 15,9, 10,8) 32,7 33,3 4’ 147,0 147,1 4’-OCH3 3,70 (s) 3,82 (s) 55,5 55,9 4a 131,7 131,8 5 6,45 (s) 6,31 (s) 106,7 106,5 5’ 6,80 (d, 8,0) 6,72 (d, 8,0) 111,6 110,7 6 141,7 142,1 6’ 6,65 (dd, 8,5, 2,0) 6,62 (dd, 8,0, 2,0) 119,9 120,4 6-OCH3 3, 78 (s) 3,85 (s) 56,1 56,4 7 132,8 133,3 8 146,5 147,0 8a 114,5 115,1 O-CH2-O 5,69 5,63 (d,1,4) 100,6 101,1
5,71 5,71 (d,1,4)
Qua số liệu phổ và so sánh với tài liệu có thể kết luận chất 1 là một hợp chất lignan, có tên là hypophyllanthin. Hợp chất này đã được phân lập từ cây
Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria, có hoạt tính kháng virut viêm gan B mạnh.
3.2. Xác định và định lượng hypophyllanthin
3.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của hypophyllanthin
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,5ppm; 1ppm; 2 ppm; 5ppm; 10ppm; 50ppm. Sau đó tiến hành đo sắc ký với các thông số như mục 2.4.2.3, Ghi các sắc đồ như hình 3.4- hình 3.9. Xác định diện tích píc hypophyllanthin trong từng dung dịch chuẩn, kết quả thể hiện ở bảng 3.2. Xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ dung dịch chuẩn, kết quả thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 1 ppm.
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 5 ppm.
Hình 3.9: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 50ppm.
Bảng 3.2: Diện tích píc của hypophyllanthin tương ứng với từng nồng độ chuẩn TT Nồng độ chuẩn ppm Diện tích píc 1 0,5 11,79967 4 1 23,56700 2 2 47,05600 3 5 114,9500 5 10 227,62 6 50 1163,6382
Từ kết quả đã xác định được ở bảng 3.2, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ ta có đường chuẩn của Hypophyllanthin như sau:
Phương trình đường chuẩn hypophyllanthin có dạng: y= 23,27154x – 0,781347.
Hình 3.10: Đường chuẩn hypophyllanthin.
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương phápphân tích phân tích
3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tính hiệu đo.
3*SD LOD
a
=
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu coi là độ lệch chuẫn của các phép đo lặp lại của dung dịch có nồng độ nhỏ.
Tiến hành đo lặp lại 10 lần xác định diện tích píc của dung dịch chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 0,5 ppm, kết quả đo được và tính toán thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả tính độ lệch chuẩn 10 phép đo lặp lại xác định diện tích píc của hypophyllanthin Lần đo (dung dịch chuẩn Hypophyllanthin 0,5ppm) Diện tích píc Nồng độ(ppm) 1 11.79967 0.540618 2 12.18857 0.55733 3 11.97341 0.548084 4 11.94625 0.546917