Hình1.4: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100.
Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính.
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích. - Phần tách: là phần trung gian của hệ thống sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuyêch đại, computer phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
1.4.3. Chọn điều kiện sắc ký 1.4.3.1. Lựa chọn pha động
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được các điều kiện sau:
- Pha động phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp quá trình tách.
- Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững theo thời gian, nghĩa là nó không bị ảnh hưởng hay phân hủy khi chạy sắc ký.
- Pha động phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho kết quả tách.
- Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cần bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tùy theo bản chất của từng loại sắc ký.
- Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích, không làm hư hại đến detector. Ví dụ, nếu dùng detector UV-VIS thì pha động phải có tính chất trong suốt trong các vùng phổ đó, hay dùng detector huỳnh quang thì pha động phải có tính chất không phát huỳnh quang...
- Pha động phải không khan hiếm và có tính kinh tế cao.
1.4.3.2. Lựa chọn pha tĩnh
Một trong những yếu tố quan trọng của HPLC đó là cột sắc ký (có nhồi chất nhồi bên trong) gọi là pha tĩnh. Việc tách chất có tốt hay không phụ thuộc nhiều vào pha tĩnh của cột. Pha tĩnh phải đáp ứng được các yêu cầu sử
dụng trong HPLC như: Trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định, tính chất bề mặt phải ổn định, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt các cân bằng động học, có độ lặp lại cao trong quá trình tách, cỡ hạt phải tương đối đồng nhất . Nếu xét về trạng thái của pha tĩnh người ta chia sắc ký thành sắc ký lỏng – lỏng và sắc ký lỏng – rắn.
Trong hệ sắc ký lỏng thì pha tĩnh là chất lỏng, nó được giữ trong cột tách bằng một chất mang trơ.
Còn trong hệ sắc ký lỏng – rắn thì pha tĩnh là một chất rắn xốp có hạt chất nhồi đường kính 3 đến 10µm. Hầu hết các công trình hiện nay đều sử dụng loại pha tĩnh rắn. Pha tĩnh rắn được chia làm một số loại như sau: Pha tĩnh trên nền silicagel (là chủ yếu), pha tĩnh trên nền nhôm oxit và pha tĩnh trên nền các chất cao phân tử hữu cơ.
Pha tĩnh trên nền nhôm oxit cho kết quả tách không ổn định do nó có rất nhiều loại thù hình mà trong đó chỉ có dạng gama mới có tính chất sắc ký tốt. Chính vì vậy nó chỉ được sử dụng nhiều trong sắc ký hấp phụ cổ điển mà ít dùng trong HPLC.
Pha tĩnh trên nền cao phân tử sử dụng cho kỹ thuật HPLC chưa nhiều do việc ứng dụng nó còn nhiều hạn chế. Nhược điểm của loại pha tĩnh này là dễ bị trương nở khi thay đổi thành phần dung môi rửa giải, khả năng chịu áp kém, độ trơ với kiềm và axit không cao, các nhóm amin trong phân tử dễ bị phân hủy, vì thế người ta chỉ sản xuất một vài loại chất nhồi này cho sắc ký trao đổi ion.
Pha tĩnh trên nền silicagel là loại được dùng nhiều nhất hiện nay trong HPLC.
- Sắc ký pha thường: chất nhồi trong sắc ký phân bố thường là các silica trung tính, trên bề mặt nó có nhóm hoạt động –OH, các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silicagen được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN...). Do có nhóm này nên chất nhồi cột loại này là phân cực và nước dẫn đến ảnh hưởng nhiều đến độ lặp lại cũng như hiệu quả của quá trình tách sắc ký.
- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silicagel được alkyl hóa, sunfonic hóa, nitro hóa hay amin hóa các nhóm –OH trên bề mặt silicagen. Việc alkyl hóa silica trung tính bằng mạch cacbon thẳng như –C2, -C8, -C18
hay các gốc cacbon vòng như nhân phenyl đã tạo ra chất nhồi pha ngược. Gốc alkyl có thể gắn trực tiếp vào mạch silicagel hoặc có thể gắn gián tiếp qua nguyên tử O. Các chất nhồi loại này dùng để tách các chất không phân cực, phân cực và sắc ký cặp ion. Dung môi chạy sắc ký là những chất phân cực như nước, methanol, acetonitril,... Vì pha tĩnh là loại kỵ nước nên bề mặt hoạt động của nó không bị ảnh hưởng bởi các phân tử nước do vậy sự tách bằng chất nhồi này có độ lặp lại tốt. Trong nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực . Sắc ký phân bố pha đảo bao gồm cả sắc ký trao cặp ion: để tách hỗn hợp các cặp cation hoặc anion người ta đưa vào một anion hoặc cation, một đối ion vào pha động, chất này liên kết với pha tĩnh không phân cực và chuyển nó sang dạng trao đổi ion. Khi chất phân tích đi qua cột, cặp ion được hình thành và lưu giữ trên pha tĩnh. Quá trình rửa giải đưa chất phân tích ra khỏi cột theo nguyên tắc sắc ký phân bố pha đảo nhưng phức tạp hơn vì cân bằng giữa pha tĩnh và thuốc thử tạo cặp ion diễn ra chậm, sự hình thành cặp ion phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ thuốc thử tạo cặp ion, nhiệt độ.
hai loại là chất nhồi pha thường (silicagel trung tính) và chất nhồi pha ngược (silicagel đã được alkyl hóa). Trong hai loại này chất nhồi pha đảo lại được dùng nhiều hơn cả vì nó có thể tách được cả các chất phân cực, ít phân cực và không phân cực. Mặt khác pha động của nó là những chất phân cực tan trong nước (nước cũng có thể là thành phần pha động), vì thế nó rất kinh tế và phù hợp cho nước có độ ẩm cao và khí hậu không ổn định như Việt Nam .
1.4.3.3. Detector
Các chất tách ra khỏi nhau được pha động đẩy đến detector để đo, tín hiệu phát hiện được chỉ thị sang bộ phận ghi nhận kết quả và được biểu diễn dưới dạng píc sắc ký. Bộ phận phát hiện (detector) để phát hiện các chất trong HPLC có nhiều loại. Tùy theo tính chất hóa lý của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng các loại detector khác nhau. Nhưng dù theo tính chất nào thì nó cũng phải thỏa mãn biểu thức mối quan hệ.
A = k.C
Trong đó: A là tín hiện đo chất phân tích trong mẫu.
k là hằng số điều kiện thực nghiệm của detector đã chọn. C là nồng độ chất phân tích.
Detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục. Nó là bộ phận thu nhận và hát hiện các chất hay hợp chất dựa theo tính chất nào đó của chất phân tích. Detector là một trong những bộ phận quan trọng của HPLC. Một detector lý tưởng phải đạt được những yêu cầu sau: có độ nhạy phân tích cao, đáp ứng được các chất cần phân tích hoặc đặc trưng của chúng, không phá hủy mẫu, không nhạy cảm với các thay đổi nhiệt độ và tốc độ dòng của pha động, có thể vận hành liên tục, cho độ lặp lại tốt và dễ sử dụng. Vì vậy, việc lựa chọn detector quyết định sự thành công của mỗi phương pháp HPLC riêng biệt. Trong số các detector được sử dụng bao gồm detector UV, điện hóa, độ dẫn điện khúc xạ, huỳnh
quang, tán xạ bay hơi và mỗi loại detector lại có ưu điểm và nhược điểm riêng. Hầu hết các chất hay hợp chất phân tích đều có tính chất hấp phụ quang trong vùng UV-Vis vì vậy detector UV-Vis hay detector PDA được sử dụng thông dụng trong phân tích. Detector huỳnh quang có hạn chế hơn so với UV- Vis do tính chất phát quang của các chất hay nhóm hợp chất không phải là thông dụng mà chỉ một số ít các chất và hợp chất có phát quang. Nhưng hạn chế đó cũng là ưu điểm của detector huỳnh quang đối với chất hay hợp chất có tính chất phát quang, nên sử dụng detector huỳnh quang cho độ nhạy và độ chọn lọc cao hơn rất nhiều so với detector UV-Vis, đối với các chất có huỳnh quang .
Ngày nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến và mở rộng, như detector mảng diot, detector khối phổ (MS), detector điện hóa do dòng, detector đo độ dẫn điện, detector đo thế, detector hấp thụ nhiệt, detector mảng diot phát quang và nhiều detector khác như đo độ siêu, đo độ cảm ứng, đo độ linh động của chất… giúp người phân tích phát hiện chính xác chất phân tích theo đúng bản chất và tính chất đặc trưng của nó.
1.4.4. Tiến hành đo sắc ký
1.4.4.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để đảm bảo máy hoạt động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng… đúng theo thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Cột sắc ký phải được kiểm tra theo định kỳ, khi rửa đúng quy định cho mỗi lần chạy sắc ký.
1.4.4.2. Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho HPLC phải là loại tinh khiết. Các hóa chất cũng là loại tinh khiết cho HPLC.
Pha dung môi pha động phải đúng, chính xác theo tỷ lệ. Lọc dung môi qua màng lọc 0,45µm và đánh siêu âm.