1.4.1.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay đây là phương pháp áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng.
Ưu điểm của HPLC:
- Điều kiện phân tích khá dễ dàng.
- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao. - Độ lặp lại cao.
- Thường không phân hủy mẫu trong quá trình phân tích.
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha động. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha tĩnh và pha động. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất hóa học của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha
tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.4.1.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết. Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động. Như vậy, nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C.. Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C.. sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3.
Chất phân tích A + B + C F1 F2
Pha tĩnh F3 Pha động
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại.
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.
Trong HPLC, tùy bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách mà người ta người ta chia thành:
- Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là chất lỏng rất ít phân cực, pha động là dung môi ít phân cực, có độ ổn định và lặp lại kém, dùng để tách và phân tích các chất không phân cực và phân cực, các chất vô cơ và hữu cơ.
- Sắc ký hấp phụ, có 2 loại:
+ Sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC): Đây là phương pháp tách chất phân tích dựa trên sự phân cực. NP-HPLC sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực. Các chất phân tích phân cực tương tác và được giữ lại bởi pha tĩnh phân cực. Sự hấp phụ tăng mạnh khi sự phân cực của chất phân tích tăng và có sự tương tác giữa các chất phân tích phân cực với pha tĩnh phân cực làm tăng thời gian rửa giải.
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Có pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực. RP-HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc tương tác kỵ nước, đó là kết quả của lực đẩy giữa dung môi phân cực với chất phân tích không phân cực và pha tĩnh không phân cực. Liên kết của các chất phân tích với pha tĩnh tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc xung quanh đoạn phân tử của chất phân tích khi kết hợp với các phối tử trong dung môi nước.
- Sắc ký trao đổi ion (IE) và cặp ion (IP): Sắc ký trao đổi ion là dựa trên sự trao đổi giữa các ion pha tĩnh và pha động. Ion mang điện tích bị loại bỏ. Đây là dạng sắc ký được sử dụng rỗng rãi trong làm sạch nước, sắc ký trao đổi ligand, sắc ký trao đổi ion của protein, sắc ký trao đổi anion có pH cao của carbohydrat oligosaccarit.
- Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC): là tách các hạt dựa trên cơ sở kích thước. Nó rất có lợi cho việc xác định cấu trúc bậc ba và cấu trúc bậc bốn của protein và axit amin. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi cho việc xác định khối lượng phân của polisacarit.
1.4.1.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
a. Thời gian lưu
Thời gian lưu (tR) là thời gian từ khi bơm mẫu vào cột đến khi xuất hiện điểm cực đại của píc. Nếu thời gian lưu càng lớn thì chất đó lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng chậm.
Hình 1.3: Píc sắc ký và thời gian lưu.
Thời gian chết (tM) là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, được tính từ khi bơm mẫu đến khi pha động đi qua cột.
Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’= tR – tM.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: bản chất chất tan, bản chất và tốc độ pha động, bản chất pha tĩnh và một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong một phép phân tích, nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém. Còn nếu tR
quá lớn ( tR>20 phút) thì píc bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích kéo dài. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Hệ số phân bố K
Trong quá trình sắc ký, khi một chất đang di chuyển trên cột và phân bố giữa hai pha, nếu ta cho pha động dừng lại để phân bố đạt tới trạng thái cân bằng thì ta có:
Trong đó: CS; CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Nếu K càng lớn thì sự di chuyển chất cần tách qua pha tĩnh càng chậm, hỗn hợp các chất cần tách có giá trị K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ. Hệ số K phụ thuộc vào bản chất hai pha, bản chất của chất phân tích, nhiệt độ...
c. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng K’ còn gọi là thừa số dung lượng hay hệ số phân bố khối lượng. Hệ số dung lượng K’ là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để mô tả tốc độ di chuyển của một chất.
Hoặc
Trong đó: QS, QM là lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động. VS, VM là thể tích pha tĩnh, pha động.
Hệ số dung lượng K’ không phụ thuộc vào bản chất hai pha, bản chất của chất phân tích, nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào cột (tỷ lệ VS/VM).
Để tách một hỗn hợp các chất, người ta thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích tối ưu sao cho giá trị K’ dao động từ 1 ÷ 5. Nếu K’ << 1 quá trình rửa giải thường diễn ra quá nhanh, các píc sẽ xuất hiện quá sớm và dễ lẫn với các píc của tạp chất. Nếu K’ >> 5 thời gian phân tích thường kéo dài.
d. Độ chọn lọc α
Vì (tR)A > (tR)B nên hệ số chọn lọc α > 1. Trong thực tế để tách 2 chất A và B ra khỏi nhau thì giá trị α dao động trong khoảng 1,05÷2 , nếu α quá lớn thì thời gian phân tích dài.
e. Hiệu lực cột và đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột tách được đặc trưng bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết N và Chiều cao tương đương của đĩa lý thuyết H .
Giả sử cột sắc ký có chiều dài là L, chia thành N đĩa, mỗi đĩa có chiều cao H. Công thức tính số đĩa lý thuyết:
Trong đó: tR là thời gian lưu.
µC là độ lệch chuẩn ứng với độ rộng của píc.
Hiệu lực cột tách càng cao khi cột sắc ký có số đĩa (N) càng lớn và chiều cao tương đương của đĩa lý thuyết H càng nhỏ.
Trong thực tế phân tích chiều cao tương đương của đĩa lý thuyết thường từ 0,1 – 1mm.
* Mối liên hệ giữa độ rộng (W) với độ lệch chuẩn µC của píc sắc ký. Trường hợp 1: Nếu độ rộng được tính là khoảng cách giữa 2 điểm uốn trên đường cong.
Khi đó độ rộng W = 2µC;
Trường hợp 2: Nếu độ rộng được tính là khoảng cách giữa 2 điểm trên đường cong ứng với nửa chiều cao.
Khi đó độ rộng W1/2 = 2,354 µC;
Trường hợp 3: Nếu độ rộng ứng với tiếp tuyến trong. Khi đó độ rộng W1/2 = 4 µC;
f. Độ phân giải RS
Độ phân giải là đại lượng sử dụng để xác định mức độ tách hai chất trên cột sắc ký, được xác định dựa trên biểu thức :
Ta thấy nếu hai píc cùng cỡ thì:
RS = 0,75 Hai píc tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều. RS = 1,0 Hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%. RS = 1,5 Hai píc tách hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%.
Nếu hai píc có độ lớn khác nhau càng nhiều thì RS càng lớn hơn nữa mới tách được tốt.
Hình1.4: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính.
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích. - Phần tách: là phần trung gian của hệ thống sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuyêch đại, computer phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
1.4.3. Chọn điều kiện sắc ký 1.4.3.1. Lựa chọn pha động
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được các điều kiện sau:
- Pha động phải trơ với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kỳ một tính chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp quá trình tách.
- Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững theo thời gian, nghĩa là nó không bị ảnh hưởng hay phân hủy khi chạy sắc ký.
- Pha động phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số cho kết quả tách.
- Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cần bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tùy theo bản chất của từng loại sắc ký.
- Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích, không làm hư hại đến detector. Ví dụ, nếu dùng detector UV-VIS thì pha động phải có tính chất trong suốt trong các vùng phổ đó, hay dùng detector huỳnh quang thì pha động phải có tính chất không phát huỳnh quang...
- Pha động phải không khan hiếm và có tính kinh tế cao.
1.4.3.2. Lựa chọn pha tĩnh
Một trong những yếu tố quan trọng của HPLC đó là cột sắc ký (có nhồi chất nhồi bên trong) gọi là pha tĩnh. Việc tách chất có tốt hay không phụ thuộc nhiều vào pha tĩnh của cột. Pha tĩnh phải đáp ứng được các yêu cầu sử
dụng trong HPLC như: Trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định, tính chất bề mặt phải ổn định, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt các cân bằng động học, có độ lặp lại cao trong quá trình tách, cỡ hạt phải tương đối đồng nhất . Nếu xét về trạng thái của pha tĩnh người ta chia sắc ký thành sắc ký lỏng – lỏng và sắc ký lỏng – rắn.
Trong hệ sắc ký lỏng thì pha tĩnh là chất lỏng, nó được giữ trong cột tách bằng một chất mang trơ.
Còn trong hệ sắc ký lỏng – rắn thì pha tĩnh là một chất rắn xốp có hạt chất nhồi đường kính 3 đến 10µm. Hầu hết các công trình hiện nay đều sử dụng loại pha tĩnh rắn. Pha tĩnh rắn được chia làm một số loại như sau: Pha tĩnh trên nền silicagel (là chủ yếu), pha tĩnh trên nền nhôm oxit và pha tĩnh trên nền các chất cao phân tử hữu cơ.
Pha tĩnh trên nền nhôm oxit cho kết quả tách không ổn định do nó có rất nhiều loại thù hình mà trong đó chỉ có dạng gama mới có tính chất sắc ký tốt. Chính vì vậy nó chỉ được sử dụng nhiều trong sắc ký hấp phụ cổ điển mà ít dùng trong HPLC.
Pha tĩnh trên nền cao phân tử sử dụng cho kỹ thuật HPLC chưa nhiều do việc ứng dụng nó còn nhiều hạn chế. Nhược điểm của loại pha tĩnh này là dễ bị trương nở khi thay đổi thành phần dung môi rửa giải, khả năng chịu áp kém, độ trơ với kiềm và axit không cao, các nhóm amin trong phân tử dễ bị phân hủy, vì thế người ta chỉ sản xuất một vài loại chất nhồi này cho sắc ký trao đổi ion.
Pha tĩnh trên nền silicagel là loại được dùng nhiều nhất hiện nay trong HPLC.
- Sắc ký pha thường: chất nhồi trong sắc ký phân bố thường là các silica trung tính, trên bề mặt nó có nhóm hoạt động –OH, các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silicagen được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN...). Do có nhóm này nên chất nhồi cột loại này là phân cực và nước dẫn đến ảnh hưởng nhiều đến độ lặp lại cũng như hiệu quả của quá trình tách sắc ký.
- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silicagel được alkyl hóa, sunfonic hóa, nitro hóa hay amin hóa các nhóm –OH trên bề mặt silicagen. Việc alkyl hóa silica trung tính bằng mạch cacbon thẳng như –C2, -C8, -C18
hay các gốc cacbon vòng như nhân phenyl đã tạo ra chất nhồi pha ngược. Gốc alkyl có thể gắn trực tiếp vào mạch silicagel hoặc có thể gắn gián tiếp qua nguyên tử O. Các chất nhồi loại này dùng để tách các chất không phân cực, phân cực và sắc ký cặp ion. Dung môi chạy sắc ký là những chất phân cực như nước, methanol, acetonitril,... Vì pha tĩnh là loại kỵ nước nên bề mặt hoạt động của nó không bị ảnh hưởng bởi các phân tử nước do vậy sự tách bằng chất nhồi này có độ lặp lại tốt. Trong nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực . Sắc ký phân bố pha đảo bao gồm cả sắc ký trao cặp ion: để tách hỗn hợp các cặp cation hoặc anion người ta đưa vào một anion hoặc cation, một đối ion vào pha động, chất này liên kết với pha tĩnh không phân cực và chuyển nó sang dạng trao đổi ion. Khi chất phân tích đi qua cột, cặp ion được hình thành và lưu giữ trên pha tĩnh. Quá trình rửa giải đưa chất phân tích ra