PHải nói lên khả năng ứng dụng của nó như thế nào? Và ít nhất phải nêu 3 ứng dụng
VIII.1)SẢN XUẤT NẤM MEN BÁNH MÌ
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 83
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Men bánh mì là sinh khối của nòi men sacchromyces cerevisiae vẫn con sống khi trộn với bột nhào sẽ lên men rượu và CO2 làm nở bánh mì.
Sản xuất nấm men bánh mì dưa trên quá trình sinh sản và tăng sinh khối của một số nòi nấm men. Trong quá trình này đường trong môi trường nuôi cấy được tiêu hao vào hai mục đích:lên men và hô hấp. Kết quả lên men là sự tạo thành rượu etylic và C02,còn hô hấp đưa đến tổng hợp các axit amin,axit nucleic và protein.
Trong điều kiện kị khí nấm men gây lên men rượu. Nếu tăng dần lượng oxi trong môi trường tới 7mg/l thì có thể loại trừ được sự lên men rượu và thu được sinh khối men bánh mì.
Hàm lượng oxi trong môi trường tới 1mg/l làm ức chế hoàn toàn khả năng sinh sản của nấm men. Nhu cầu oxi phụ thuộc vào tời gian tuổi của tế bào.1g men trẻ cần 80-100 mg/h còn các tế bào già 40-60mg/h.
Trong các nhà máy sản xuất nấm men không khí được nén và được thổi vào các thùng nuôi men ở các dạng hạt hoặc dòng nhỏ phân tán. Lưu lượng không khí thổi qua các môi trường nuôi cấy là 30-100m3/h.
Nguyên liệu được dùng trong sản xuất sinh khối nấm men bánh mì là rỉ đường-phế phẩm của công nghiệp đường hoặc các dịch bã rượu.
Rỉ đường sử dụng trong sản xuất men bánh mì có những yêu cầu sau :hàm lượng chất khô không thấp hơn 75%,đường 40-50%, hàm lượng chất tro không thấp hơn 7,5%, tổng nitơ không thấp hơn 1,4%, số lượng tổng các vi sinh vật không quá 15000 tế bào trong 1g rỉ đường.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 84
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Rỉ đường trước khi pha môi trường nuôi nấm men cần được xử lí. Trước tiên pha loãng rỉ đường theo tỉ lệ 1:1,1:4,axit hóa bằng axit H2S04
tới pH=5 rồi làm sạch theo phương pháp hoá học hoặc phươg pháp cơ học. Trong phương pháp hoá học người ta cho thêm vào dich rỉ đường các chất kết lắng để kết tủa các chấ keo. Phương pháp cơ học dùng các máy ly tâm đĩa(seperator) để tách cặn của rỉ đường. Khi kết tủa các chất keo người ta có thể đun nóng rỉ đường tới 80-1000C để giết tạp khuẩn.
Bã rượu sau khi chưng cất cồn là một loại nguyên liệu tốt dùng để nuôi cấy nấm men. Bã rượu nói chung có khoảng 90-95% nước,chất khô khoảng từ 5-10%. Trong số các chất hoà tan của bã rượu có đường(1- 2,5%),các hợp chất nitơ,các vitamin nhóm B. Ngoài ra trong ba rượu còn có các nguyên tố khoáng ,các nguyên tố vi lượng .Như vậy trong bã rượu còn có hơi ít đường, nhưng rất phong phú các chất kích thích sinh trưởng ,Vì vậy khi dùng bã rượu để nuôi cấy nấm men người ta lọc lấy phần dịch trong rồi bổ sung từ 1-3% rỉ đường, thêm superphootphat. để tăng nguồn Proteins và (NH4)2S04 hoặc urê làm nguồn nitơ.
Quá trình nuôi men có thể chia thành 3 giai đoạn: nhân giống thuần khiết trong phòng thí nghiệm (giai đoạn A), nhân giống thuần khiết tự nhiên trong sản xuất (giai đoạn B), và nuôi men lớn (Giai đoạn Carbergellsis). Ở các nhà máy nhân giống ở phòng thí nghiệm và qua sản xuất phải tiến hành qua nhiều cấp để có đủ lượng tế bào men nuôi cấy ở giai đoạn C trong các thùng tới hàng trăm mét khối. Giống thuần khiết ở giai đoạn B có thể thu được ở dạng sữa men sau khi ly tâm tách hoặc ép
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 85
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
thành bánh dùng cho giai đoạn C ở cùng nhà máy, hay một số nhà máy khác. Men nuôi cấy sau thay cho men A.
Nhiệt độ nuôi cấy khoảng 29-300C. Trong suốt quá trình nuôi cấy ở giai đoạn B và Cần phải thông khí. Men Carbergellsis được tách bằng hệ ly tâm đĩa và lọc ép hoặc lọc chân không. Men sữa được qua sấy phun thành men bột có thể bảo quản được lâu dài. Men thương phẩm ở dạng bánh ép có 73-75% độ ẩm hoặc ở dạng các viên hay sợi khô có 7,5-9% độ ẩm được gọi là men khô. Ngoài ra ở các nhà máy bánh mì có thể tổ chức một phân xưởng sản xuất men nước để cung cấp cho nhu cầu của mình. Men nước dùng riêng để sản xuất bánh mì hoặc trộn lẫn với men khô hoặc men ép để giảm lượng dùng các men này đồng thời nâng cao đươc chất lượng bánh.
Quá trình sản xuất men bánh mì tương tự sản xuất sinh khối nấm men proteins đơn bào., chỉ khác là các chủng nuôi cấy khác nhau và men bánh mì là những tế bào men còn sống.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 86
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Hình 8.1. Sơ đồ công nghệ chuẩn bị môi trường dinh dưỡng nuôi cấy giống nấm men thuàn chủng (nhân giống) từ dịch bã rượu tinh bột
VIII.3) Sản xuất rượu etylic
VIII.3.1) nguyên liệu sản xuất rượu
Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu gồm có:
Các loại hạt củ cớ chứa nhiều tinh bột như các loại ngũ cốc:gạo, ngô, đại mạch,cao lương… và các loại củ:sắn, khoai tây…
Các loại rỉ đường từ mía hoặ từ củ cải đường.
Dịch thuỷ phân từ gỗ (chủ yếu là xenllulose hay hemixenllulose).
Chúng ta chỉ làm quen với hai loại lên men đó là lên men từ tình bột và lên men từ dịch rỉ đường.
VIII.3.2)Nuôi cấy nấm men trong quá trình lên men rượu
Trong nồi lên men cần phải tiến hành nhân giống để men giống sinh sôi đủ lượng tế bào có khả năng lên men tuỳ thuộc vào quy mô sản
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 87
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
xuất. Qúa trình nhân giống tiến hành nhiều cấp. Trong thực hiện lên men công nghiệp, cần phải đủ lượng tế bào nấm men, có độ trẻ, khoẻ, sinh sản mạnh. Đối với men rượu số lượng tế bào sacharomyces vào khoảng 120 triệu-160 triệu tế bào/1ml dịch lên men(sau khi nuôi cấy 12h)
Giống từ môi trường thạch nghiêng cấy sang bình môi trường lỏng 10ml,rồi sang bình tam giác 100ml, sang bình cầu 1000ml,10l,100l,1000l…nuôi men từ thùng 100l cần phải thổi khí và khoảng 1-2h thì khuấy trộn môi trường 1 lần. Trong qúa trình nuôi cần phải duy trì nhiệt độ thích hợp đối với nấm men, nói chung cần giữ nhiệt độ 30-320C.
Môi trường nhân giống từ 100ml-10l như sau:
Đối với tinh bột thường dùng môi trường nước đường hoá có nồng đôj 12-14Bx hoặc 6-7 Be và pH 4-4,5.(tương đương 1,2-2g H2SO4/l). Đối với men rượu rỉ đường thường dùng môi trường rỉ đường đã được xử lí như sau:rỉ đường pha loãng đến 40 Bx điều chỉnh bằng H2SO4 tới pH 4,5, đun sôi trong 1h, rồi để yên trong 1-2 ngày, lọc bỏ cặn. Rỉ đường sau khi xử lí thì pha loãng đến 12-14 Bx(6-7 Be), thêm (NH4)2SO4 :0,2-0,5%, superphotphat:0,2-0,5%, điều chỉnh pH 4,5-4,8 (tương đương 1,2-1,5g H2SO4).
Môi trường ở các nồinuôi giống tiếp theo cũng giống như trên, nhưng được thêm chất sát trùng Na2SiF6-0,02%. Trong nồi lên men chính dịch đường cần đạt đến nồng độ 90-120g/l (khoảng 12-14Bx), pH cần phải ở khoảng 4,5-4,8 để hạn chế các loại vi sinh vật tạp nhiễm. Môi trường sau khi thanh trùng thì được tiếp men giống và cho lên men tất cả
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 88
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
khoảng 65h, trong đó 10h đầu cần phải sục khí để men sinh sản đủ lượng tế bào, sau đó cho lên men tĩnh và kị khí.
Nấm men sau khi lên men có thể dùng lại cho đợt sau, nhưng phải làm sạch các I sinh vật tạp nhiễm theo cách sau: axit hoá bằng H2SO4 tới pH 2,7-3 giữ ở pH này 3-4 giờ và kiểm tra bằng kính hiển vi, khi có tới 50% lượng tế bào nấm men bị chết thì men được chuyển vào cấy trong dịch đường mới lên men.
VIII.3.3) Lên men
Sau khi đã chuẩn bị xong lên men có nồng độ 16-18% chất khô hoà tan (tương đương với 13-15% độ đường) cùng với chất sát khuẩn cũng như bổ sung các nguồn dinh dưỡng. Nhiệt độ lên men 28-320C, pH=4,2- 5,2. Tế bào nấm men tiếp tục sinh sản và sinh khối phát triển đến nồng độ rượu là 5% sẽ dừng lại hoặ phát triển chậm dần đến ngừng hẳn. Quá trình lên men được tiến hành trong vòng 23 ngày. Đối với nhữngnòi nấm men chịu được nồng độ cao khi lên men đường giảm xuống 6-8%, có khi bổ sung thêm đường và như vậy nấm men sẽ tiếp tục chuyển hoá đường thành rượu, năng suất lên men được tăng lên. Bình thường một quá trình lên men với nồng độ đường ban đầu 13-15% thì rượu tạo thành là 7-8%, nếu bổ sung đường có kết quả:tổng đường trong lên men có thể tới trên 20% và lượng rượu sinh ra cũng nhiều hơn.(có khi đạt 10%).
Quá trình lên men rươu cần chú trọng:
Chống nhiễm tạp khuẩn, bảo vệ quá trình lên men.
Làm nguội cho các thùng lên men( ở nước ta lên men mùa hè, nhiệt độ của dịch lên men là 350C,thường phun nước dôi từ trên xuống quanh
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 89
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
thùng). Trường hợp lên men ở nhiệt độ cao dẫn đến các hậu quả xấu, sinh ra nhiều sản phẩm phụ, giảm chất lượng sản phẩm…
Lên men rượu có thể tiến hành lên men gian đoạn theo từng mẻ, lên men bán liên tục hay lên men liên tục.
VIII.3) Thu nhận chế phẩm enzim invectaza từ sacharomyces cerevisiae
Nghiên cứu này khảo sát quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase. Đầu tiên, sử dụng phương pháp thực nghiệm thay đổi giá trị của một yếu tố và cố định các giá trị của những yếu tố còn lại để xác định điều kiện thích hợp cho quá trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase. Kết quả thu được như sau: tỉ lệ khối lượng giữa nấm men/dung môi (dung dịch đệm acetate): 1/6, nhiệt độ tự phân: 500C, pH ban đầu: 5,5 và thời gian tự phân: 50 giờ. Khi đó hoạt tính invertase thu được là 94,7 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men. Tiếp theo, tối ưu hóa hai yếu tố nhiệt độ và pH ban đầu của quá trình tự phân bã nấm men bia bằng phương pháp trực giao bậc hai cấu trúc có tâm. Kết quả cho thấy giá trị nhiệt độ và pH tối ưu của quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase lần lượt là 450C và 5,5. Khi đó, tổng hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme invertase thu được trong dịch tự phân là 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men và 0,7 đơn vị hoạt tính/mg protein.
VIII.3.1) GIỚI THIỆU
Nấm men bia thuộc loài Saccharomyces cerevisiae, có hoạt tính enzyme invertase (EC
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 90
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
VIII.3.2.1). Enzyme này thường tập trung chủ yếu trong lớp không gian chu chất của tế bào nấm men. Ngành công nghiệp sản xuất bia hàng năm thải ra một lượng rất lớn bã nấm men bia. Trung bình sản xuất 100 lít bia sẽ thu được 2 lít bã nấm men với độ ẩm 88%. Hiện nay, bã nấm men bia được sử dụng để sản xuất bột chiết nấm men (yeast extract) hoặc làm thức ăn gia súc.
Sản xuất chế phẩm invertase từ bã nấm men bia là một hướng nghiên cứu mới tại Việt
Nam. Trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất nước giải khát, kẹo… chế phẩm invertase thường được sử dụng để thủy phân đường sucrose tạo sản phẩm đường nghịch đảo. Dung dịch đường nghịch đảo có độ ngọt cao hơn và ít bị hiện tượng tái kết tinh đường hơn so với dịch đường sucrose.
Trong nghiên cứu này, khảo sát quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase thô. sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc
hai, cấu trúc có tâm để xác định các điều kiện tối ưu của quá trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase.
VIII.3.2) NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VIII.3.2.1)Nguyên liệu
Bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong nghiên cứu này do nhà máy bia Hòa Bình (402 – 404 Tùng Thiện Vương, quận 8, Thành phố Hồ Chí Minh) cung cấp.
VIII.3.2.2)Phương pháp nghiên cứu
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 91
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Qui trình công nghệ: Bã nấm men bia → Rửa với nước vô khuẩn và nước muối → Tách
cặn → Tự phân → Ly tâm tách cặn không tan → Chế phẩm invertase thô
Trong quá trình tự phân nấm men, hệ enzyme tự phân có sẵn trong tế bào nấm men được
hoạt hóa. Chúng xúc tác phản ứng phân giải các chất có trong thành tế bào nấm men và giải
phóng enzyme invertase ra ngoài tế bào. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định các thông số kỹ thuật tối ưu của quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase có hoạt tính cao nhất.
Trước khi thực hiện quá trình tự phân, bã nấm men bia dạng sệt thu được từ nhà máy bia
được đem phối trộn với nước vô khuẩn theo tỉ lệ nấm men/nước là 1/3 (w/w), rồi để lắng trong 1 giờ và gạn bỏ phần nước bên trên. Tiếp tục phối trộn sinh khối nấm men với dung dịch nước muối NaCl (0,5%) theo tỉ lệ 1/3 (w/w). Sau 1 giờ, gạn nước và tiến hành ly tâm (3000 vòng/phút) để thu nhận sinh khối nấm men. Tiếp theo, sinh khối nấm men được phối trộn với dung dịch đệm để thực hiện quá trình tự phân. Sau quá trình tự phân, mẫu được ly tâm (7000 vòng/phút) để tách bỏ phần không tan, phần dịch lỏng thu được là chế phẩm invertase thô. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm: sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để xác định các thông số kỹ thuật tối ưu của quá trình tự phân. Các hệ số hồi qui được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Student, sự tương thích của
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 92
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
phương trình hồi qui với thực nghiệm được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Fisher.
VIII.3.2.3) Các phương pháp phân tích
Lượng sinh khối nấm men được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không
đổi và được biểu diễn bằng số gam chất khô nấm men.
Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ, sử dụng thuốc thử 3, 5 DiNitroSalycylic acid (DNS). Lượng protein hòa tan được xác định bằng phương pháp Lowry. Phương pháp xác định hoạt tính invertase: cho vào erlen 4ml dung dịch đệm acetate pH 4,5; 4,6 ml nước cất và 0,4ml dịch chứa enzyme. Thêm vào 1ml dung dịch đường sucrose nồng độ 20g/l. Cho phản ứng enzyme xảy ra chính xác trong 15 phút. Sau đó xác định lượng lượng đường khử tạo thành bằng phương pháp DNS, từ đó suy ra số mol sucrose đã bị thủy phân. Một đơn vị hoạt tính invertase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1 micromol đường sucrose trong 1 phút ở điều kiện pH 4,5 và nhiệt độ 300C.
VIII.3.3)KẾT LUẬN
Quá trình tự phân bã nấm men bia là giai đọan quan trọng trong qui trình công nghệ thu
nhận chế phẩm invertase. Nó quyết định đến giá trị hiệu suất thu hồi enzyme từ bã nấm men. Sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm, đã xác định được các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase như sau: tỉ lệ nấm men/dung môi: 1/6 (w/w), nhiệt độ tự phân:
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 93
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
450C, Ph ban đầu: 5,5 và thời gian tự phân: 50 giờ. Trong điều kiện này, tổng hoạt tính và hoạt tính riêng của chế phẩm invertase thu được lần lượt là 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men và 0,7 đơn vị hoạt tính/mg protein.
VIII.4)Ứ ng dụng công nghệ lên men để nâng cao độ tinh khiết của