IV)NGHIÊN CỨU TẾ BÀO NẤM MEN DƯỚI KÍNH HIỂN VI
IV.1) Hình thái sinh sản
dùng tiêu bản giọt ép hoặc giọt treo. Cách là như sau:
Tiêu bản giọt ép:
Ta nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính khô, dùng que cấy lấy một ít tế bào nấm men ở khuẩn lạc hoặc từ ống thạch nghiêng cho vào giọt
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 59
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
nước, rồi di nhiều lần cho tế bào men rải đều trong giọt nước, đậy một lam kính lên giọt nước. Chú ý khi đậy lam kính sao cho phần ép giữa lam kính và vật kính không có một bong bóng khí nào, chỉ là nước với tế bào nấm men. Đem soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600 lần ( vật kính 40x và thị kính 50x).
Tiêu bản giọt treo
Ngoài hình thái tế bào còn có thể quan sát sự nảy chồi của nấm men. Lấy một giọt dịch có chứa nấm men bằng vòng que cấy vô khuẩn rồi chấm lên lam kính đã vô khuẩn, quay ngược lam kính xuống phía dưới rồi úp lam kính lên một phiến kính chuyên dùng đã vô khuẩn có một vết lõm hình tròn ở giữa. Giọt giống huyền phù chấm trên lam kính phải đúng vào giữa vết lõm (hình 10.3). Mép của lam kính được bôi bằng parafin nóng chảy hoặc vazơlin để không khí không ra vào được vết lõm. Như vậy, ta có thể quan sát sự sinh sản của tế bào nấm men hàng ngày.
Mỗi tiêu bản giọt treo ta có thể theo dõi, quan sát hình thái và sinh sản nấm men hàng ngày. Thời gian lưu giữ có thể 8-10 ngày.
Nhuộm tế bào và đánh giá chất lượng nấm men
Trong nghiên cứu, cũng như trong sản xuất không chỉ theo dõi quan sát hình thái tế bào mà còn phải thường xuyên đánh giá tình trạng sinh lí của tế bào nhờ các tiêu bản nhuộm tế bào. Giống nấm men được coi là trẻ khoẻ có hình thái tế bào đặc trưng, số tế bào trẻ và nảy chồi nhiều, số tế bào chết ít (<=5%). Tốc độ sinh sản nhanh, số tế bào chứa chất dinh dưỡng dự trữ (hạt glycogen) nhiều.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 60
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
IV.2) Đếm số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy để xác định tốc độ sinh sản và sinh trưởng của nấm men
Đếm số lượng tế bào thường áp dụng phương phápbuồng đếm Goriaev-Thom. Buồng đếm (hình 10.4) là phiến kính dầy được chia thành phần đều nhau bằng các vạch thẳng.. Phần giữa của phiến kính lõm xuống mỗi cạnh thấp 1/10 mm, trên đó có vạch một mạng lưới. Diện tích của ô vuông lớn của lưới là 1/25 mm2, diện tích của ô vuông nhỏ là 1/400mm2. Cho dịch huyền phù (một giọt) lên lưới và phủ bằng một lam kính. Miết vài lần sao cho lam kính với hệ trạng lưới phiến kính không còn bọt kh, không còn khoảng trông không chứa dịch.
Trừ các ô vuông. Như vậy, khoảng không gian giữa lam kính và phần giữa của phiến kính đủ chia thành ô lưới sẽ tạo thành buồng đếm. Các tế bào nấm men được đếm trên các ô lớn của lưới (bằng số lượng của mỗi ô nhỏ cộng lại). Thể tích của mỗi ô này là 1/250mm3. Ta phải đếm số lượng tế bào nằm trong các ô của lưới cũng như trên các cạnh phía trên và phái bên phải ủa môi ô. Vì độ chính xác của việc xác định phụ thuộc vào chỗ lam kính có áp suất vào bề mặt của buồng đếm hay không, cho nên tốt nhất là đếm lặp lại số lần, mỗi lần đếm 150-200 tế bào. Nếu bắt đầu đếm sau khi đã cho giống vào buồng đếm khoảng 3-5 phút, để cho tế bào lắng xuống, để cho tế bào lắng xuống, khi soi kính ta thấy chúng trên cùng một mặt phẳng.
Số lượng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù được tính theo công thức:
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 61
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
M =
hxS
ax100
hxS ax100
ở đây: M- số lượng tế bào (triệu)/ml; a-số lượng tế bào trung bình;
h- chiều sâu của buồng đếm, 1/10 mm; S- diện tích ô vuông lớn,1/25mm2.
Đếm số lượng tế bào bằng phương pháp pha loãng rồi cấy trên hộp Pectri có môi trường thạch, nuôi vài ngày rồi đếm khuẩn lạc rồi suy ra số lượng tế bào theo hệ pha loãng. Phương pháp này chỉ đếm được tế bào sống và mất nhiều thời gian. Sơ đồpha loãng xem hình 10.1.
Xác định mức độ sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục trên máy so màu với bước sóng 580-650nm (nanomet), thường dùng lọc màu đỏ 620nm.
Nếu phương pháp này lọc đường cong chuẩn với mối tương quan OD và số lượng tế bào (qua đếm tế bào) thì ta có thể suy ra sô lượng tế bào nấm men 1ml dịch huyền phù.
PHương pháp này chỉ thích hợp cho các môi trưởng lỏng đồng nhất, có thể không chính xác, nhưng cho phép ta xác định được sự sinh trưởng và phát triển của giống nghiên cứu.
IV.3) Nghiên cứu hình thái bào tử của nấm men