III)KĨ THUẬT NUÔI CẤY
III.4.3)KĨ THUẬT CẤY MẪU VÀ Ủ MẪU
vi sinh vật khác nhau.hơn nữa các vi sinh vật khác nhau nhưng có quan hệ gần nhau thì có thể phat triển thành khuẩn lạc có đặc diểm tương tự nhau. Chính vì vậy,việc chọn môi trường phân lập đóng vai trò rất quyết định hiệu quả phân lập. Thông thường các môi trường chuyên biệt cho sự của một vi sinh vật nào đó được sử dụng để phân lập vi sinh vật này.
Tuy nhiên việc nuôi cấy vi sinh vật đòi hỏi các kĩ thuật vô trùng. Bằng các kĩ thuật vô trùng, người thao tác thí nghiệm có thể ngăn ngừa giống vi sinh vật và các dung dịch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 47
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Hình 3.1. Sơ đồ pha loãng dung dịch huyền phù nấm men và cấy lên môi trường thạch ở hộp pectri
không mong muốn. Thao tác các kĩ thuật vô trùng phải chính xác cũng giúp người thí nghiệm tránh các vi sinh vật gây bệnh.
1 -Vệ sinh sạch các khu vực thí nghiệm bằng các hoá chất sát trùng để giảm tối đa lượng vi sinh vật gây nhiễm
2-Các dụng cụ cấy chuyền phải được tiệt trùng
3- Các thao tác phải được thực hiện nhanh chính xác có hiệu quả để rút ngắn thời gian, qua đó giống vi sinh vật có thể bị nhiễm
Các bước cấy chuyền nấm men từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác phải được thực hiện như sau
1-Đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn
2-Mở nút bông hay nắp và hơ miệng ống nghiệm hay lọ chứa vi sinh vật trên ngọn lửa đèn cồn
3-Thu một ít vi sinh vật bằng que cấy và chuyển qua môi trường tinh khiết
4-Hơ lại miệng ống nghiệm hay lọ trên ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông hay nắp lại
5-Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn
Các kĩ thuật vô trùng đối với hộp pectri cũng được thực hiện tương tự Như vậy người làm thí nghiệm phải
1-Luôn luôn tiệt trùng que cấy bằng cách đốt trước khi đưa nó vào bất kì một ống nghiệm nào chứa giống vi sinh vật
2-Luôn hơ miệng ống nghiệm hay lọ chứa vi sinh vật trước khi đưa que cấy tiệt trùng vào ống nghiệm để lấy hoặc cấy giống vi sinh vật
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 48
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
3-Luôn luôn đậy kĩ các ống nghiệm hay lọ… đựng giống vi sinh vật với các nắp tương ứng khi không thực hiện cấy chuyền.tuyệt đối tránh nhầm lẫn các ống nghiệm này nới nắp ống nghiệm kia. Không đặt các nắp ống nghiệm hay nắp dĩa pectri lên mặt bàn hay tiếp xúc với bất cứ vật gì khac ngoài ống ngiệm hay dĩa pectri đựng gống vi sinh vật tương ứng để tránh lây nhiễm.khi chuyển các khuẩn lạc,vào đĩa Perti,sử dụng nắp đĩa như là vật che chắn,bảo vệ giống khỏi bị nhiễm bằng cách nâng nghiên nắp đĩa lên một góc đủ để đưa que cấy vào.
4-Thao tác chính xác khi mở nút hay nắp ống nghiệm/lọ. 1-Đối với vi sinh vật hiếu khí
Cấy mẫu
Tuỳ theo yêu cầu từng loại môi trường mà cách gieo cấy khác nhau. Sau đây là những cách hay dùng:
1. Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác
2. Gieo cấy trên thạch nghiêng
3. Cấy đâm sâu trên thạch đứng
4. Cấy trên thạch hộp.
Cách 1:Trộn vật gieo cấy lỏng vào thạch trước khi đổ ra hộp. Trình tự tiến hành như sau:
o Dùng hộp pectri đã vô khuẩn, chưa có thạch o Đun chảy ống thạch, để nguội 50-550C
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 49
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
o Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy cho vào ống thạch đậy nút bông lại.
o Khẽ lắc ống thạchhoặc lăn nó giữa hai bàn tay để trộn đều vật gieo cấy với thạch, thạch dàn đều ra trên đáy hộp.
o Để yên cho thạch hoàn toàn đặc lại, lật ngược hộp và cho vào tủ ấm để nuôi.
Cách 2:Trộn vật gieo cấy vào hộp thạch, tiến hành như trình tự sau: o Dùng hộp pectri đã vô khuẩn, chưa có thạch
o Đun chảy ống thạch để nguội 50-550C
o Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy lỏng ,hé mở hộp, nghiêng qua nghiêng lại hoặc xoay nhẹ hộp để chúng dàn đèu trên đáy hộp.
o Hé mở nắp hộp, nhanh tay đổ thạch vào, đậy nắp và xoay nhẹ vài vòng trên bàn cho thạch và vật gieo cấy trộn đều đồng thời dàn thành một lớp trên đáy hộp.
o Để thạch đặc lại, lật ngược hộp, cho vào tủ ấm.
Cách 3: Dàn đều vật gieo cấy trên bề mặt thạch. Tiến hành trình tự như sau:
o Dùng hộp thạch vô khuẩn
o Dùng pipet lấy một ít vật gieo cấy lỏng
o Hé mở nắp hộp và cho vật gieo cấy lên mặt thạch
o Dùng que trang( bằng thuỷ tinh) dàn đều vật gieo cấy trên mặt thạch (que trang phải chuẩn bị trước, sạch, khô, bọc giấy, vô khuẩn)
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 50
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
o Đậy nắp hộp, để yên một lúc cho mặt thạch ráo nước, quay ngược hộp, cho vào tủ ấm.
o Thể tích các mẫu (kể cả pha loãng và không pha loãng) được cấy lên thạch đĩa thường là 0.1ml. Tránh cấy mẫu với thể tích lớn,vì như thế thạch sẽ không hấp thụ hết mẫu và chất lỏng còn lại trên mặt thạch sẽ làm cho các khuẩn lạc phát triển dính liền như sau khi ủ.
o -Lấy que gạt vô trùng (nhúng vào cồn 90o,rồi đốt cháy với ngọn lửa đèn cồn,để nguội trong vài dây,phân bố đều mẫu lên mặt thạch đậy nắp dĩa lại,để thạch thấm hút hết mẫu trong vòng vài phút.
o -Úp ngược đĩa thạch rồi đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.tuỳ theo từng loại vi sinh vật mà thời gian ủ khác nhau.
2) Đối với vi sinh vật kị khí
o Chưng cách thuỷ môi trường trong ống nghiệm để đuổi hết oxi trong môi trường
o Để môi trường nguội đến 45-500C. Cấy 0.1ml dung dịch các mẫu (pha loãng và không pha loãng) vào môi trường đậy kín lại và lắc ống nghiệm quanh trục của nó để phân bố đều mẫu trong môi trường
o -Rót thật nhanh môi trường trong ống nghiệm này ra đĩa pectri rồi đậy nhanh nắp đĩa lại
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 51
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
o -Dùng paraphin dán kín kẻ hở giữa đáy đĩa và nắp đĩa rồi đem ủ ở nhiệt độ thích hợp . Thời gian ủ phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật cần phân lập.
Thông thường các vi sinh vật khác nhau có khuẩn lạc mang những đặc điểm khác nhau trên môi trường phân lập. Sử dụng que cấy khối môi trường có khuẩn lạc đặc trưng phát triển riêng lẻ rồi cấy vào môi trường dịch thể .để ủ môi trường lỏng nhiệt độ và thời gian thích hợp để kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật.
Ủ mẫu:
Trong trường hợp nuôi tĩnh được thực hiện trong tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ. Với từng loài ta cần giữ nhiệt độ tối thích cho nó phát triển hoặc những khoảng nhiệt độ cần nghiên cứu. Máy lắc có những tốc độ khác nhau được đặt trong các phòng có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ. Nếu nuôi giống nhiều thể tích lớn phải cung cấp đủ khí oxi, sục khí và dùng các loại cánh khuấy thích hợp Các giống hiếu khí thường nuôi trên máy lắc trong bình tam giác hoặc bình cầu có nút bông.
Sau khi cấy xong, ta nuôi ở 25-280C trong vòng 4-5 ngày
Trên môi trường lỏng vi sinh vật phát triển khắp môi trường, có thể tạo thành váng, làm đục môi trường, có trường hợp lắng xuống đáy các dạng kết tủa hình bông, sợi lơ lửng lắc khó tan hoặc dễ tan…, sinh ra mùi hoặc màu đặc trưng.
Trên môi trường đặc mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc. Khi quan sát ta nên chú ý các khuẩn lạc phát triển đứng riêng rẽ, xem hình dạng kích thước, rìa mép, nhìn bề mặt xem bóng, mịn ướt, khô, gợn sóng,
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 52
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
nhăn heo, nhìn xem toàn bộ đục mờ hay trong suốt, xem màu sắt và ngửi mùi…
III.4.4)Phát hiện và chọn khuẩn lạc đặc trưng
Sau khi nuôi trong một thời gian ngắn,vi sinh vật đã mọc giống tốt, chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ, mọc tốt đều và đẹp hoặc những điểm giống mọc tốt trên đường ziczac chuyển vào môi trường lỏng ( dịch malt, dịch quả) đã vô khuẩn trong ống nghiệm hoặc trong bình tam giác. Nuôi 2-3 ngày ở 280C để giống phát triển. Từ đây ta tiến hành phân lập lại một lần nữa (có thể qua quá trình pha loãng) để chọn các khuẩn sạch từ các khuẩn lạc riêng rẽ, mọc tốt trên bề mặt môi trường đặt trong đĩa pectri.
Chú ý:
Sau 2 ngày , vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn
Phải chọn khuẩn lạc thật riêng biệt. Phương pháp phân lập trên môi trường đặc là phương pháp thông dụng, dễ làm và kết quả tương đối đảm bảo nhưng có thể có những nhược điểm sau:
Khuẩn lạc có thể không phát sinh từ một tế bào mà từ nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu.
Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng biệt, nhưng qua một thời gian ngắn chúng lài dính liền với nhau.
Để khắc phục những nhược điểm đó và đảm bảo canh trường hoàn toàn thuần khiết ta có thể tiếp tục phân lập như trên vài lần, đồng thời làm tiêu bản quan sát để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách. :Phương pháp cấy ria
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 53
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Phương pháp cấy ria góc
o Tạo các góc phần tư bằng cách vẽ hai đường vuông góc bên ngoài đáy đĩa thạch chia dĩa thạch làm 4 phẩn bằng nhau
o Đốt nóng que cấy vòng ,để nguội trong vòng vài giây rồi đưa que cấy vào trong ống nghiệm chứa vi sinh vật và lấy một ít vi sinh vật này
o Chạm nhẹ que cấy lên bề mặt thạch rồi trược nhẹ que cấy theo đường ziczac liên tục trên ¼ dĩa thạch đã được chia.sử dụng nắp đĩa để bảo vệ bề mặt thạch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật rơi từ không khí vào.tránh thọc sâu que cấy vào trong thạch
o Đốt nóng que cấy để nguội chạm đầu que cấy vào thùng thạch thuộc góc phần tư thứ nhất (đã được cấy ria) ,trượt que cấy từ vùng này qua vùng thạch thuộc góc phần tư thứ hai,rồi tạo đường ziczac liên tục trên góc phần tư này. Luôn luôn đốt nóng que cấy sau mỗi lần tạo vạch trên mỗi góc phần tư của thạch,làm như vậy sẽ tiêu diệt bất cứ tế bào bám vào đầu que cấy và tránh cho lần cấy ria tiếp theo bị nhiễm .
o Lặp lại các ước cấy ria như thế trên vùng thạch thuộc góc phần trên thuộc góc phần tư thứ ba và thứ tư.
o Đốt nóng đầu que cấy lần nữa sau khi đã ria xong trên một đĩa thạch
Phương pháp cấy ria liên tục
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 54
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
o Lấy một ít giống vi sinh vật lên que cấy và trược đều đầu que cấy lên một nữa bề mặt thạch theo một đường ziczac liên tục
o Không đốt nóng que cấy và không đưa que cấy ra khỏi đĩa,không quay bề mặt đầu que cấy, quay đĩa thạch 900và tiếp tục tạo đường ziczac liên tục như đã làm như trên vùng thạch trước đó
o Chuẩn bị đĩa cấy ria đối chứng trong đó người tiến hành cấy ria chỉ sử dụng que cấy đã tiệt trùng không có vi sinh vật sống bám vào.chỉ cần sử dụng một trong hai phương pháp cấy ria trên. Đây là những đĩa chỉ thị cho kĩ thuật vô trùng. Nếu các kĩ thuật vô trùng được thực hiện chính xác,sẽ không có bất cứ vi sinh vật nào phát triển trên những đĩa này.
III.4.5) Kiểm tra tính thuần khiết của nấm men:
Kĩ thuật vô trùng trong sản xuất là phương pháp hết sức quan trọng để khắc phục tình trạng tạp nhiễm, thông thường người ta kiểm tra nhằm phát hiện những vi sinh vật tạp niễm và phát hiện sự có mặt các thực thể của giống vi sinh vật dùng cho sản xuất.
Để phát hiện vi sinh vật tạp nhiễm, người ta thường dùng 2 phương pháp:
Phương pháp soi kính hiển vi
Phương pháp soi kính hiển vi tiện lợi và nhanh nhưng không phải bao giờ cũng cho kết quả mong muốn. Khi bị nhiễm tạp trùng có kích thước hình dáng tế bào không khác xa giống nuôi cấy dưới các trường. nhìn kíng hiển vi ta khó phát hiện được. Vì vậy cần có những phương pháp đặc biệt để xác định những tế bào sống và tế bào chết của tạp khuẩn.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 55
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
Phương pháp nuôi cấy trên một vài môi trường.
Người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy một vài giọt mẫu của môi trường nhân giống hoặc lên men trên các môi trường dinh dưỡng. Quan sát bằng mắt thường hoặc dùn kính hiển vi các tế bào sống, cũng như các tế bào chết kết hợp với nhuộm gram.
Phương pháp này cho kết quả tốt, song hơi chậm vì phải sau ít ngày mới biết kết quả được.
Những môi trường dinh dưỡng thường dùng trong phòng thí nghiệm để kiểm tra vi sinh vật thường là môi trường nước thịt-pepton gọi là “canh thang”. Có glucoza , môi trường thạch-thịt-pepton. Môi trường nước thịt –pepton gồm 1% pepton, 0,5% NaCl trong nước thịt bò. Khi cho môi trường này vào các ống nghiệm có thêm 1% glucoza , pH môi trường là+7-7,2. Môi trường thạch-thịt-pepton được chế từ môi trường nước thịt pepton thêm 2% thạch.
Phương pháp phát hiện tạp khuẩn trên hộp pectri.
Trong kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm, phương pháp đơn giản nhất là dùng hộp thạch có phân vùng để cấy các mẫy kiểm tra. Dùng bút viết thuỷ tinh chia hộp pectri ra làm nhiều vùng, ở mỗi vùng là một khâu sản xuất trong dây chuyền bằng 1 đường cấy mẫu kiểm tra lên mặt thạch.
Vùng 1,2,3 dùng để kỉêm tra giống cấp I,II,III.. Sau khi nuối ở nhiệt độ và thời gian nhất định, giống phải phát triển tốt, yêu cầu ở đâylà dạng khuẩn lạc phải hoàn toàn đồng nhất, nghĩa là giống thuần khiết.
Vùng 4,5,6,7 dùng kiểm tra các mẫu môi trường lên men sau khi đã thanh trùng và một số thành phần của môi trường vì yêu cầu kĩ thuật phải
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 56
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
thanh trùng riêng. Yêu cầu ở trường hợp này là hoàn toàn không có vi sinh vật phát triển, tức là các mẫu kiểm tra này phải hoàn toàn vô trùng. Vùng 8,9,10 dùng kiểm tra các mẫu dịch lên men sau khi đã lên men một thờigian(vd:3h-12h). Yêu cầu giống phải phát triển dày dần từ mẫu 3h đến mẫu 12h, và dạng khuẩn lạc phải hoàn toàn đồng nhất, hoàn toàn là dạng của giống sản xuất chứ không phải là một giống lạ nào khác. Một số vùng trên hộp pectri dành kiểm tra một số mẫu nữa theo yêu cầu của thực tế sản xuất.
Như vậy nếu kết quả kiểm tra vô trùng đạt đươc như đã trình bày ở trên thì vấn đề tạp nhiễm không xảy ra, ngược lại nếu đợt sản xuất bị nhiễm những vi sinh vật lạ thì ta có thể chủ động biết được là nhiễm ở khâu nào, từ đó có những phương pháp khắc phục.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 57
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
1
1,2,3: giống phát triển tốt,thuần khiết.
4,5,6,7: vô trùng, không có vi sinh vật phát triển. 8,9,10: Giống phát triển dày dần, thuần khiết.
III.4.6)Nhân giống nấm men trong công nghiệp:
Nếu đi từ một chủng nấm men mà những điều kịên tối ưu để nuôi cấy và sản xuất hoạt chất đã được xác định bằng thực nghiệm và đồng thời đã biết cách bảo vệ những đặc tính của nó qua thời gian thì tốt hơn hết nên dự trữ chủng đó ở một lượng lớn..
Từ một ống cấy lại trên môi trường đặc và nuôi trong 12-36h. Người ta pha chế một thể tích thích hợp dung treo nấm men trong nước vô khuẩn, dung treo đó dùng để gieo vào bình nón chứa môi trường có