III)KĨ THUẬT NUÔI CẤY
III.3.2) Chuẩn bị môt trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
Các nguyên vật liệu đem làm môi trường nhất thiết phải cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cho các quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men,đồng thời phải duy trì được thế oxi hoá-khử ,áp suất thẩm thấu và tạo được sự ổn định của ph thích hợp cho môi trường
-Các thành phần nguên liệu phải được cân đong chính xác và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn
-Đối với môi trường dịch thể ,các thành phần nguyên vật liệu được cân, đong rồi hoà tan với nước
- Đi với môi trường thạch bột thì cần dùng với các thành phần khác rồi hoà tan và nước ,nếu có thạch sợi thì phải cần thạch sợi ,ngâm vào nước vớt thạch ra rồi vắt khô cho vào nồi nấu môi trường để đun
III.3.2.2) Làm trong môi trường
Nếu môi trường dịch thể không có đủ độ trong cần thiết,việc làm trong môi trường giúp quan sát việt phát triển của nấm men dễ dàng hơn.có thể làm trong môi trường bằng phương pháp lọc môi trường qua bông gòn,vải thưa hay giấy lọc cũng có thể lộc môi trường bằng than hoạt tính hay lòng trắng trứng gà. Trong phương pháp lọc bằng lòng trắng trứng gà ,cứ 1 l môi trường thì phải sử dụng 1 quả trứng gà. Trước tiên trộn lòng trắng trứng với 1 thể tích nước tương đương rồi đánh cho đến khi sủi bọt. Sau đó cho hỗn hợp này vào môi trường ,khuấy đều rồi đun sôi trong vòng 10-15 phút ,để lắng và lọc
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 37
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
III.3.2.3) Điều chỉnh ph của môi trường
Các nấm men khác nhau chỉ có thể sinh trưởng trong những khoảng ph khác nhau và chỉ phát triển tối ưu tại 1 khoảng ph xác định nào đó,vì vậy ph của môi trường phải điều chỉnh sao cho thích hợp
Các chất thưòng điều chỉnh ph trong môi trường nuôi cấy:NA0H,K0H,HCL,H2SO4,NA2CO3…
Để xác định ph của moi trường,có thể sử dụng các chất chỉ thị màu như giấy quỳ tím hay xanh brômmthymol.thuy nhiên,việc sử dụng máy đo ph có sẵn trong phòng thí nghiệm cho kết quả chính xác hơn
III.3.2.4) Vô khuẩn môi trường
Phương pháp vô khuẩn và các điều kiện vô khuẩn một môi trường nào đó phụ thuộc vào tính chất của môi trường đó.phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để vô khuẩn môi trường là phương pháp hấp tiệt trùng môi trường bằng hơi nước ở áp suất cao: thiết bị auto clave thời gian 20 phút.nhiệt độ là 1210C
III.3.2.5) Làm thạch nghiêng,thạch đứng và thạch đĩa
1- thạch nghiêng
-Phân phối môi trường (có chứa thạch) vào ống nghiệm hay lọ thuỷ tinh có nút bông hay nắp đậy sau khi vô khuẩn môi trường. Thể tích môi trường được phân phối và ống nghiệm hay lọ phụ thuộc vào yêu cầu về độ dài của mặt thạch nghiêng hay độ cao của phần thạch sâu. Thông
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 38
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
thường ,người ta cho vào ống nghiệm một lượng môi trường bằng 1/3 thể tích ống nghiệm để làm thạch nghiêng
-Cần phải thực hiện các thao tác phân phối thật nhanh,gọn gàng với các kĩ thuật vô trùng để tránh nhiễm khuẩn từ bên ngoài
-Để nguội ống nghiệm hay lọ có chứa môi trường ở tư thế nghiêng góc sao cho mặt nghiêng và phần thạch đạt yêu cầu
-Để yên cho đến khi môi trường đặt lại.bề mặt thạch nghiêng phải được bằng phẳng không gồ ghề,nhẵn và liên tục.
2-Thạch đứng
-Tiến hành phân phối môi trường như đối với thạch nghiêng nhưng làm nguội ống nghiệm ở tư thế đứng.thông thường người ta cho vào ống nghiệm một lượng môi trường bằng ¾ thể tích ống nghiệm của thạch đứng
-Để yên cho đến khi môi trường đặc lại 3thạch đĩa
Proteins-việc phân phối môi trường vào thạch đĩa thường phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng
-Đĩa pectri thường phải được vô lhuẩn
-Tiến hành song song với các kĩ thuật vô trùng
-Có thề phân phối môi trường vào đĩa bằng pipet hay rót trực tiếp ra dĩa. Tuỳ vào yêu cầu cụ thể của từng thí nghiệm mà thể tích môi trường được phân phối vào dĩa có khác nhau để tạo môi trường thạch có độ dày ,mỏng khác nhau
-Lưu ý: nắp hộp chỉ được mở một phần khi cho môi trường vào
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 39
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
-Đậy nắp lại,xoay đĩa theo đường tròn ,tới lui một cách nhẹ nhàng nhưng để tránh môi trường dấy lên nắp và thành đĩa
-Để yên cho đến khi môi trường đặc lại
III.3.2.6) PHân phối môi trường vào dụng cụ chứa
Các dụng cụ chưa môi trường thường là bình tam giác,các loại ống nghiệm,hay hộp đĩa pectri. Quá trình phân phối môi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thủ một số nguyên tắc cơ bản sau:
-Môi trường phải được phân phối ở trạng thái lỏng
-Nếu dụng cụ chứa là đĩa pectri và môi trường cần phảo được vô khuẩn thì môi trường này cần phải vô khuẩn thì dĩa này cần phải hấp tiệt trùng trước khi phân phối môi trường
-Nếu dụng cụ chứa là ống nghiệm hay bình tam giác thì phải sử dụng phễu –các thao tác phân phối cần phải được nhanh gọn,khéo léo để môi trưòng không bị giấy lên miệng hay thành của dụng cụ chứa và phải hoàn thành trước khi môi trường bắt đầu hoá rắn.
III.3.2.7)Bảo quản,kiểm tra môi trường
-Môi trường chưa được sử dụng cần phải được bảo quản ở nơi khô thoáng mát tránh ánh sáng nhiệt độ phải thích hợp (thường 0-50C) và có độ ẩm thích hợp để tránh làm khô môi trường
-Thời gian bảo quản phải được tuân thủ nghiêm ngặt theo yêu cầu của từng thí nghiệm để đảm bảo chất lượng môi trường.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm 40
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương
III.4)PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP GIỐNG NẤM MEN