- Thí nghiệm được tiến hành đối với m ẫu rong m ơ được xay đến kích thước 0,25mm, với 2 loại enzyme: p - glucanase và Viscozym e 1,5% được ủ ở nhiệt độ tương ứng (550C - 600C) và (450C - 500C) với thời gian ủ được thay đổi từ 1 giờ đến 8 giờ, các điều kiện trích ly khác không đổi. (xem chương 2, phần 2.3.4). Ta có kết quả sau:
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
Enzym e Thời gian ủ (h) 1 2 3 4 5 6 7 8 P-glucanase 2,34 5,58 8,73 9,72 9,76 9,46 7,63 4,27 2,47 5,15 8,64 9,64 9,62 9,51 7,79 4,41 2,64 5,31 8,59 9,75 9,71 9,54 7,73 4,36 V iscoenzym e 3,67 5,45 6,31 9,01 9,23 9,65 9,79 9,78 4,04 5,06 6,11 8,96 9,14 9,44 9,68 9,67 3,85 5,15 6,26 8,57 9,07 9,61 9,63 9,73
- Từ kết quả trên, xử lý thông kê ta có bảng phân tích phương sai AN OV A khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ enzyme đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
Bảng 3.14 Kết quả xử lý ANOVA và LSD khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme P- glucanase đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
ANOVA Table for TYLETHUHOI by THOIGIANU
Analysis of Variance
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 162,015 7 23,145 1921,41 0,0001
Within groups 0,192733 16 0,0120458
Total (Corr.) 162,208 23
- Qua bảng phân tích phương sai ANOVA, ta thấy thời gian ủ enzyme có ảnh hưởng tỷ lệ thu hồi dịch trích ở độ tin cậy 95%. (p - value < 0,05).
Multiple Range Tests for TYLETHUHOI by THOIGIANU Method: 95.
THOIGIANU
0 percent LSD
Count Mean Homogeneous Groups
1 3 2,48333 X 8 3 4,34667 X 2 3 5,34667 X 7 3 7,71667 X 3 3 8,65333 X 6 3 9,50333 X 5 3 9,69667 X 4 3 9,70333 X
Bảng 3.15: Kết quả xử lý ANOVA và LSD đối với khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ Viscozyme 1,5% đến tỷ lệ thu hồi dịch trích từ rong nâu có kích thước 0,25mm.
ANOVA Table for TYLETHUHOI by THOIGIANU
Analysis of Variance
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 113,91 7 16,2273 35, 65 0,0000
Within groups 0,352933 16 0,0220583
Total (Corr.) 113,944 23
Multiple Range Tests for TYLETHUHOI by THOIGIANU
Method: 95.0 percent LSD
THOIGIANU Count Mean Homogeneous Groups
1 3 3,85333 X 2 3 5,23333 X 3 3 6,22667 X 4 3 8,84667 X 5 3 9,14667 X 6 3 9,56667 X 7 3 9,66667 X 8 3 9,72667 X
- Ta thấy lượng thời gian ủ enzyme có ảnh hưởng đến tỷ lệ thu hồi của dịch trích lipid từ rong nâu ở độ tin cậy 95% (P<0,05). Thời gian ủ enzyme khác nhau có ảnh hưởng
đến tỷ lệ thu hồi của dịch trích lipid. Cụ thể là, khác biệt giữa các thời gian: 1 - 2; 1 -3 ; 1 - 4; 1 - 5; 1 - 6, 1 - 7, 1 - 8, 2 - 3, 2 - 4, 2 - 5, 2 - 6, 2 - 7 , 2 - 8 , 3 - 4, 3 - 5, 3 - 6, 3 - 7, 3 - 8, 4 - 5, 4 - 6, 4 - 7 , 4 - 8, 5 - 6, 5 - 7, 5 - 8 là có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% (a = 0,05),
- Qua kết quả phân tích phương sai ANOVA ta có kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
Bảng 3.16: Kết quả ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
Enzym e
Thời gian (h)
1 2 3 4 5 6 7 8
p - glucanase 2,483a 5,316c 8,653e 9,703g 9,697g 9,503f 7, 7 4,346b Viscozyme 3,853a 5,363b 6,227C 8,847d 9,147e 9,566f 9,667g 9,726g
H ình 3.4: Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme đến tỷ lệ thu hồi dịch trích từ rong nâu.
- Qua biểu đồ trên ta thấy, tỷ lệ thu hồi tăng tỷ lệ với thời gian xử lý enzyme.
+ Đối với Viscozyme: ở thời gian 8 giờ tỷ lệ thu hồi là cao nhất (9,726%), không có khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê 5% so với mẫu được xử lý ở 6 giờ (9,566%) và 7 giờ
+ Đối với P- glucanase: Thời gian đầu khi kéo dài thời gian thủy phân, tỷ lệ thu hồi lipid tăng dần, ở thời gian 4 giờ tỷ lệ thu hồi là cao nhất (9,703%), khi tiếp tục tăng thời gian xử lý enzyme lên 5 giờ thì tỷ lệ thu hồi khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với mẫu xử lý ở 4 giờ với độ tin cậy 95%, khi tiếp tục tăng thời gian, hoạt tính enzyme giảm nên khả năng phân hủy thành tế bào giảm, quá trình hiệu suất trích ly giảm.
- Do khi kéo dài thời gian ủ enzyme thì khả năng thủy phân cơ chất của enzyme càng nhiều nên lượng chất trích ly được nhiều làm tỷ lệ thu hồi cũng tăng.
- Khi tiếp tục tăng thời gian ủ thì tỷ lệ thu hồi tăng chậm hoặc không tăng, có xu hướng giảm, có thể do:
+ Hoạt tính enzyme đã gi ảm dần theo thời gian ủ. Dưới tác động của nhiệt độ, enzyme bị biến tính ít nhiều và ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác, một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và trung tâm hoạt động của enzyme bi đứt gãy bởi nhiệt độ, mức ảnh hưởng này ngoài nhiệt độ ủ còn phụ thuộc vào thời gian ủ enzyme (độ bền nhiệt của enzyme), do đó, nếu ở nhiệt độ tối ưu của enzyme, ta kéo dài thời gian ủ thì enzyme cũng bị biến đổi, giảm hoạt tính, thời gian quá dài, enzyme cũng có thể bất hoạt.
+ Có thể do thành tế bào bị phá vỡ sinh ra các phân tử nhỏ, và giải phóng một số chất bên trong thành tế bào thoát ra môi trường ngoài, làm cản trở hoặc hạn chế bề mặt tiếp xúc của enzyme với cơ chất, vì vậy, khi kéo dài thời gian ủ hơn nữa thì tỷ lệ thu hồi cũng tăng không đáng kể.
- Kết luận: ở nhiệt độ tối ưu enzyme endo - p - glucanase hoạt động tốt trong khoảng từ 4 - 6 giờ, đạt tối đa ở 4 giờ (9,703%). Viscozyme hoạt động tốt ở khoảng 6 - 8 giờ, tỷ lệ thu hồi cao nhất ở 8 giờ (9,726%).
3.5 K h ả năng kháng oxy h óa từ dịch trích lipid thô của rong n âu theo cơ chế b ắ t gốc tự do DPPH.
- Dịch trích sau khi tách dung môi được gửi mẫu phân tích khả năng bắt gốc tự do DPPH, thu được kết quả sau:
Bảng 3.17: Kết quả phân tích khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH.
M ẫu Nồng độ Q (% )
Rong mơ 1mg/ml 31,63
- Dịch trích lipid sau khi phân tích bằng phương pháp DPPH, xác định được phần trăm bắt gốc tự do của dịch trích là 31,63% (1mg/ml).
- Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy dịch trích thu được có khả năng kháng oxy hóa, tuy nhiên, khả năng kháng oxy hóa cụ thể là khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch trích trong nghiên cứu này thấp. Điều này có thể do:
+ Nguyên liệu khô, trải qua quá trình xử nhiệt như phơi nắng, sấy nên các chất chống oxy hóa kém bền nhiệt sẽ bị phân hủy, mặc dù, nhiệt độ sấy không cao 400C nhưng nguyên liệu phải được sấy đến khối lượng không đổi nên thời gian sấy dài, các chất chống oxy hóa tiếp xúc nhiệt độ trong suốt quá trình sấy.
+ Nhiệt độ ủ enzyme khoảng 50 - 550C trong 6 giờ. Ngoài ảnh hưởng của nhiệt độ còn có yếu tố thời gian, nếu thời gian càng kéo dài, các chất chống oxy hóa phải chịu nhiệt càng lâu nên độ bền nhiệt của nó sẽ giảm xuống, hoạt tính chống oxy hóa sẽ giảm.
+ Dịch trích được bốc hơi tự nhiên để tách dung môi trong khoảng thời gian dài nên không tránh khỏi bị tiếp xúc với ánh sáng, oxy làm biến đổi, giảm hoạt tính.
+ Do dịch trích lipid chứa nhiều tạp chất và hợp chất màu cản trở khả năng hấp thụ ảnh hưởng kết quả phân tích.
3.6 P h ân tích th àn h phần acid béo có tro n g dịch trích lipid.
- Dịch trích lipid thô thu được sau khi tách dung môi, gửi mẫu phân tích thành phần acid béo bằng phương pháp sắc khí. Ta có kết quả sau:
Bảng 3.18: Kết quả phân tích thành phần acid béo bằng phương pháp sắc ký khí. Fatty acid
Rong mơ_pp: Ủ enzyme + ngâm chiết (%) Myristic acid 1,82 Palmitoleic acid 2,01 Palmitic acid 9,34 Linoleic acid 1,87 Oleic acid 3,96 Stearic acid 1,7 Arachidonic acid 3,05 Erucic acid 1,02 Behenic acid 1,14 Lignoceric acid 0,51 Heptadecanoic acid * + 11-eicosenoic acid * + Arachidic acid * +
* Có sự hiện diện của peak rất nhỏ trên sắc ký đồ nên không xác định được tỷ lệ phần trăm
- Kết quả cho thấy trong dịch trích có chứa các thành phần acid béo không no quan trọng như linoleic acid, oleic acid, arachidonic chiếm tỷ lệ tương đối cao so với các thành phàn khác trong dịch trích.
- Tổng phần trăm acid béo không no là: 9,9%, tổng hàm lượng acid béo no chiếm 16,52%. Tuy hàm lượng acid béo không no chiếm tỷ lệ cao hơn acid béo no nhưng tỷ lệ acid béo không no vẫn chiếm tỷ lệ tương đối cao.
- Hàm lượng acid béo này có thể cao hơn hoặc thấp hơn phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
+ Quá trình trích ly: dung môi trích ly hòa tan tốt các cấu tử cần tách, phương pháp trích ly (trích kiệt), quá trình ủ enzyme kéo dài làm thay đổi pH môi trường (môi trường acid) làm giảm hàm lượng acid béo trong dịch trích...
+ Quá trình bảo quản dịch trích: dịch trích tiếp xúc với ánh sáng, oxy,... bị oxy hóa làm thay đổi thành phần acid.
C H Ư Ơ N G 4: K Ế T L U Ậ N VÀ K IÉ N N G H Ị 4.1 K ết luận
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly: + Kích thước nguyên liệu thích hợp là 0,25mm.
+ Nồng độ enzyme thích hợp là 1,5% + Nhiệt độ ủ và thời gian enzyme:
Glucanase: 550C trong 4 giờ. Viscozyme: 500C trong 8 giờ.
+ Sau khi phân tích khả năng kháng oxy hóa và thành phần acid béo có trong dịch trích lipid của rong nâu thì kết quả thấp hơn so với các nghiên cứu khác.
4.2 K iến nghị
- Do thời gian thực tập ngắn nên đề tài của tôi còn nhiều thiếu sót, tôi xin đưa ra một số ý kiến đề xuất để sản phẩm được hoàn thiện hơn:
+ Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình trích ly. + Nghiên cứu thêm khả năng ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly. + Nghiên cứu trích ly bằng nhiều phương pháp khác.
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O
[1] Đặng Thị Sy (2005). Tảo Học. NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội. tr 37, 43,99,102
[2] Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (1998). Phân Loại Học Thực Vật. NXB Giáo Dục. tr 41
44.
[3] Lâm Ngọc Trâm- Đỗ Tuyết Nga- Nguyễn Phi Đính- Phạm Quốc Long- Ngô Đăng Nghĩa (1999). Các Hợp Chất Tự Nhiên Trong Sinh Vật Biển Việt Nam. NXB Khoa
Học Kỹ Thuật. tr 5-50.
[4] Nguyễn Hữu Dinh et al (1993), Rong biển việt nam phần miền bắc, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật.
[5] Nguyễn Hữu Đại (1992), Góp phần nghiên cứu họ rong m ơ (sargassaceae) ven biển miền trung việt nam, luận án phó tiến sĩ khoa học sinh hoc, Trường Đại Học Tổng Hợp
Hà Nội.
[6] Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong mơ Việt Nam nguồn lợi và sử dụng, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM.
[7] Phạm Đức Thịnh (2007), Tách chiết và phân tích thành phần các polysacarit tan trong nước từ một số loài rong nâu Việt Nam, luận văn thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu và Ứng
Dụng Công Nghệ Nha Trang, Khánh Hòa.
[8] Phạm Hoàng Hộ (1972). Tảo Học. Trung Tâm Học Liệu Bộ Giáo Dục. tr 43, 73, 274
281.
[9] ThS. Nguyễn Thị Kim Oanh, “ Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà xanh để ứng dụng vào thực phẩm và dược phẩm”, Đại học Quốc gia Tp, HCM, 2004.
[10] Trần Thị Luyến - Đỗ Minh Phụng - Nguyễn Anh Tuấn - Ngô Đăng Nghĩa (2003),
Chế biến rong biển, nhà xuất bản Nông Nghiệp
[11] Vũ Trung T ạng (1979), Nguồn lợi sinh vật biển đông, NXB Khoa Học và Kĩ Thuật. [12] Ajisaka T, Noro T, Yoshida T (1995b) ZygocarpicSargassumspecies (Subgenus
Sargassum) from Japan. In Abbott IA (ed) Taxonomy o f Economic Seaweeds with Reference to Some Pacific Species vol. 5, California Sea Grant College System: 11-44 [13] Ajisaka T, Phang SM, Yoshida T (1999) Preliminary report of Sargassumspecies
collected from Malaysian coasts. In Abbott IA (ed) Taxonomy of Economic Seaweeds with Reference to Some Pacific Species vol. 7, California Sea Grant College System: 23-41
[14] A. Rosenthal, D. L. Pyle, and K. Niranjan (1996), “Aqueous and enzymatic processes for edible oil extraction”. Enzyme and Microbial Technology 19, p. 402-420
[15] Chiang Y-M, Yoshida T, Ajisaka T, Trono GC Jr, Tseng CK, Lu B(1992) Distribution and variation in Sargassum polycystumC.A. Agardh (Fucales, Phaeophyta). In Abbott IA (ed) Taxonomy of Economic Seaweeds with Reference to Some Pacific and Western Atlantic Species vol. 3, California Sea Grant College: 35-42
[16] Maeda et al. (2005). Biochem, Biophys, Res. Comm. 332:392-397.
[17] Miyashita et al. (2011). J. Sci. FoodAgric. 91:1166-1174 2011.
[18] Myoung-Nam Woo et al. (2009). Mol.Nutr. Food Res. 1603-1611.
[19] Narayan et al.(2008). Biocatalysis and Bioenergy (Ho, C.T. ed), John Wiley & Sons,
Inc., pp. 463-490.
[20] Pokorny J., Yanishlieva N., Gordon M., “Antioxidants in food”, CRC Press, 2001 [21] Public Heath service Food and drug Administration Washington DC November 14,
2000.
[22] Teas J., Pino S., Critchley A., Braverman L. E., Thyroid (2004). Variability o f iodine content in common commercially available edible seaweeds. Vol.14, No. 10, p. 836
841.
[23] Terasaki et al.(2009). J. Phycology. 45:974-980, 2009. [24] Tsukui et al. (2007) J. Agric. Biol. Chem. 55:5025-5029 [25] h ttp ://http://www.fao.org
[26] http:// vi.wikipedia.org/wiki/Dung_môi [27] http://www.seaweed.ie/algae/phaeophyta.html
P H Ụ L Ụ C 1. P hương pháp xác định độ ẩm tro ng nguyên liệu.
- M ục đích: Xác định độ khô của nguyên liệu.
- Nguyên tắc: Dưới tác dụng của nhiệt độ, nước trong nguyên liệu bay hơi dần cho đến trước khi đạt độ ẩm không đổi. Dựa vào sự chênh lệch khối lượng của nguyên liệu trước và sau khi tách ẩm để xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu.
- Cách đo ẩm : Dung máy sấy ẩm, Sấy đĩa cân đến độ ẩm không đổi rồi cho khoảng cho a (g ) mẫu vào đĩa sấy. Khởi động chế độ sấy, quá trình đo ẩm bắt đầu cho đến khi giá trị ẩm hiển thị không đổi nữa là kết thúc quá trình.Giá trị hiển thị cuối cùng trên mấy là độ ẩm trong nguyên liệu. Đơn vị ẩm % (KL ẩm.KL mẫu đo).
2. P hương pháp sấy.
- Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô.
- C ách tiến hành: khởi động tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ thích hợp, cho mẫu vào sấy đến độ ẩm cần thiết.
3. Xay (nghiền).
- M ục đích: Giảm kích thước nguyên liệu.
- Nguyên tắc: Dùng lực cơ học để cắt nhỏ nguyên liệu. 4. C ân định lượng.
- M ục đích: Xác định khối lượng để thu số liệu tính toán. - Thiết bị: cân ba lẻ
5. P hương pháp sắc ký khí.
- M ục đích: Xác định thành phần acid béo trong dịch trích.
- Nguyên tắc: Nguyên tắc cơ bản của sắc ký là dựa vào sự khác biệt của ái lực của các cấu tử trong hỗn hợp chất cần phân tích với pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất lỏng nhớt được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt chất rắn nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất ở lại. Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động. Sự tác động này đối với từng cấu tử khác nhau là khác nhau. Vì vậy khi cho hỗn hợp chất cần phân tích đi qua bề mặt pha tĩnh thì các cấu tử sẽ bị tách khỏi nhau và từ đó có thể định tính cũng như định lượng chúng. Sắc ký khí: pha động là khí trơ không có lực tương tác hóa học hay vật lý với chất cần phân
6. P hương pháp b ắ t gốc tự do D PPH
- M ục đích: Xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch trích.
- Nguyên tắc: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chóng oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng. Đo độ hấp thu tại bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa trong mẫu cần phân tích. Ascorbic acid được sử dụng làm chất đối chiếu.
- Tiến hành: Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH: > Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ (1mg/ml)
- DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM - Mẫu được pha ở nồng độ ban đầu Co=30 mg/ml
- Cho 100ụl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800ụl methanol, sau đó bổ sung 100ụl dịch mẫu.