Trích ly kết hợp hỗ trợ enzyme là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong nguyên liệu bằng dung môi dưới sự kết hợp của enzyme phân hủy vách tế bào thực vật, sẽ cải thiện hiệu suất trích ly.
- Tách chiết dầu bằng enzyme được xem là một kỹ thuật mới trong công nghiệp khai thác dầu và chất béo do nó có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống:
+ Hạn chế việc sử dụng dung môi, tiết kiệm chi phí đầu tư và năng lượng. + Cho phép loại bỏ các độc tố và hợp chất phi dinh dưỡng trong nguyên liệu. 1.3.1 C ở sở lý thuyết của phương pháp trích ly.
- Độ hòa tan vào nhau của chất phụ thuộc vào hằng số điện môi, hai chất lỏng có hằng số điện môi càng gần nhau thì khả năng tan lẫn vào nhau càng lớn.
- Hằng số điện môi lipid khoảng 3 đến 3,2 các dung môi hữu cơ có hằng số điện môi khoảng 2 đến 10, do đó có thể dùng các dung môi hữu cơ để hòa tan lipid chứa trong nguyên liệu, dưới tác dụng của enzyme phân hủy vách tế bào thực vật làm tăng khả năng thấm của vách tế bào. Như vậy, phương pháp trích ly lipid kết hợp enzyme là phương pháp dùng enzyme phá hủy cấu trúc nguyên liệu, dùng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid có trong nguyên liệu rắn ở điều kiện xác định. Vì vậy, bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán.
1.3.2 C ơ chế tác động của enzyme [14]
- Lớp vách bao quanh tế bào: gồm có cellulose, hemicellulose, ligin, pectin,... Trong phương pháp chiết xuất bằng dung môi, hạt được nghiền nhỏ làm vách tế bào bị đứt gãy, phơi bày các túi dầu bên trong tế bào để lipid dễ dàng khuếch tán vào dung môi, trong khi đó protein được giữ lại cùng với chất xơ và carbohydrat.
- Trong phương pháp tách chiết dầu bằng enzyme, các enzyme như cellulase, hemicellulase hay pectinase nhằm phá vỡ cấu trúc của vách tế bào hoặc protease để thủy phân protein trên màng tế bào cũng như bên trong tế bào chất. Ngoài ra, các protease thủy phân
1.3.3 C ác yếu tố ảnh hưởng đến q u á trìn h trích ly (có hỗ tr ợ của enzyme)[14].
1.3.3.1 Nguyên liệu
a. M ức độ p h á vỡ cấu trú c nguyên liệu:
- Mức độ cơ học hay lý học của các mô ảnh hưởng ngược lại trên năng suất trích ly. Đây là một nhân tố cơ bản đẩy nhanh và làm triệt để tiến trình trích ly bởi dung môi. Với cấu trúc tế bào hoàn toàn bị phá vỡ, các phân tử có thể tiếp xúc hoàn toàn với dung môi. (Kitrigin, 1976)
- Kích thước và hình dáng các hạt nguyên liệu ảnh hưởng nhiều đến vận tốc chuyển động của dung môi qua lớp nguyên liệu, quá trình thẩm thấu sẽ làm nhanh hay chậm quá trình trích ly, nếu kích thước và hình dáng thích hợp, sẽ có được vận tốc chuyển động tốt nhất của dung môi vào khe vách cũng như các hệ mao quản của nguyên liệu, kích thước các hạt bột trích ly dao động từ 0,5mm đến 10mm (tùy bản chất nguyên liệu), nếu kích cỡ quá mịn sẽ làm giảm khả năng thấm của lớp vật liệu rắn vào dung môi, do làm tắt ống mao dẫn dung môi không thể thấm qua.
b. Ả m độ của các ph ân tử:
- Ẩm độ cao sẽ làm chậm quá trình khuếch tán và gây ra sự dính bết giữa các phân tử. Nước còn lại trong nguyên liệu sẽ liên kết protein và các chất háo nước khác, ngăn chặn sự thấm của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán và đối lưu.
1.3.3.2 Tỷ lệ dung môi v à nguyên liệu
- Với khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định, khi lượng dung môi gia tăng, quá trình trích ly diễn ra nhanh chóng và lượng dầu còn lại trong bã sẽ giảm.
- Theo lý thuyết, khi giảm tỷ lệ nguyên liệu: dung môi thì sự chênh lệch về nồng độ giữa dung môi và nguyên liệu càng lớn tức động lực quá trình khuếch tán càng lớn. Do đó, các thành phần trong nguyên liệu có xu hướng đi vào dung môi nhiều hơn, tuy nhiên, không phải giảm tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là độ khuếch tán liên tục tăng mà tăng chậm dần và hầu như không tăng nữa ở một tỷ lệ nhất định.
1.3.3.3 N hiệt độ trích ly
- Bản chất tán sẽ được tăng cường do độ nhớt của lipid trong nguyên liệu giảm làm tăng vận tốc chuyển động của lipid vào dung môi. Nhưng nhiệt độ quá cao sẽ gây tổn thất nhiều dung môi và lipid bị biến tính.
1.3.3.4 Thời gian trích ly
- Sự kéo dài của thời gian kéo theo sự tăng năng suất trích ly nhưng không nên kéo dài vì hiệu suất trích ly không tăng lên bao nhiêu. Thời gian trích ly hợp lý sẽ tiết kiệm được năng lượng và dung môi mà lượng chất trích ly là tương đối cao nhất.
1.3.3.5 C hủng loại enzyme
- Các enzyme khác nhau sẽ có vai trò khác nhau trong việc thủy phân cấu trúc nguyên liệu. Carbohydrase (pectinase, cellulase, hemicellulase) đặc hiệu cho các thành phần vách tế bào thúc đẩy quá trình giải phóng dầu trong dung môi.
- Lượng enzyme bổ sung vào càng cao, thời gian phản ứng càng dài thì lượng chất trích ly được càng tăng.
- Ngoài ra, nhiệt độ ủ và pH cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả tác động của enzyme. 1.3.3.6 Loại dung môi
- Nhiều dung môi như benzen, etanol, propan, aceton, n - h e x a n ,. đã được dùng để trích ly lipid. Việc lựa chọn dung môi dựa trên các vấn đề: hằng số điện môi là một dấu hiệu tốt cho độ phân cực, điểm sôi, hay các chỉ số khác như khả năng trộn lẫn với các dung môi khác hay tính dễ dàng làm sạch nó. Trong thực tế không tồn tại dung môi lý tưởng, nhưng lựa chọn dung môi sử dụng phải dựa vào các yêu cầu sau:
+ Hoà tan chọn lọc: dung môi chỉ hòa tan cấu tử cần tách. + Không tác dụng hoá học.
+ Khối lượng riêng khác: phân lớp tốt với dung dịch còn lại, khối lượng riêng của dung môi chọn phải nhỏ hơn khối lượng riêng của dung môi đầu.
+ Không phá hủy thiết bị. + Không biến đổi khi bảo quản. + Không gây độc, rẻ, dễ kiếm. + Dễ tách và thu hồi.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1 Đối tượng nghiên cứu.2.1.1 Rong nâu 2.1.1 Rong nâu
- Đối tượng nghiên cứu là rong mơ nâu có tên khoa học là Sargassum feldmannii được thu mua từ Khánh Hòa, có độ ẩm ban đầu là 16%.
2.1.2 Viscozyme
- Viscozyme được sản xuất bởi một chủng chọn của nấm Aspergillus aculeatus.
- Viscozyme chứa một loạt các carbohydrases bao gồm arabanase, cellulase, beta- glucanase, hemixenlulaza, xylanase và pentosanase. Nó cũng phá vỡ các chất pectin nhánh tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Các điều kiện tối ưu cho Viscozyme là pH 7 - 8 và nhiệt độ 50 - 550C.
2.1.3 Enzym e P- glucanase
- SEBflo-TL là một endoglucanase (hay endo - P-1,4-glucanase) thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo thành oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose hoặc cellobise. Được sản xuất từ chủng Trichoderma (Claeyssens et
al.,1989)
- Endo-P -1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết p -1,4-glucosidie bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobise và glucose. Endo-P -1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.
- Nhiệt độ hoạt động ổn định của SEBflo-TL là 30 - 700C, hoạt tính enzyme giảm và ngừng hoạt động tại 700C. pH tối ưu là 4 - 6,5. Tại điểm pH thấp hơn 3 hoặc pH lớn hơn 6,5 enzyme bắt đầu ngừng hoạt động.
2.2 Phương pháp nghiên cứu.2.2.1 Phương pháp. 2.2.1 Phương pháp.
- Sấy. - Ủ enzyme.
- Đo ẩm. - Ngâm chiết.
- Xay. - Phương pháp sắc ký khí.
- Rây. - Phương pháp bắt gốc tự do DPPH.
2.2.2 H óa ch ất v à dụng cụa. H óa chất a. H óa chất
- Methanol, chloroform.
- Enzyme p - glucanase, Viscozyme. b. Dụng cụ
- Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP Hồ Chí Minh:
+ Cân điện tử: 3 số lẻ hiệu ASIX 2.3 Bố tr í th í nghiệm
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu thí nghiệm một nhân tố, mô hình bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên.
2.3.1 Thí nghiệm 1: K hảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ th u hồi
- Mục đích: Chọn ra kích thước thích hợp cho quá trình trích ly.
- Tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành đối với hai loại enzyme p - glucanase, Viscozyme tương ứng rong mơ có 3 kích thước khảo sát: 0,25mm, 0,5mm, 0,63mm. Rong nâu trộn với nước theo tỷ lệ rong nâu/nước (g/ml) là 1:7, nhiệt độ ủ 550C, thời gian ủ là 6 giờ. Rong sau khi ủ enzyme sẽ được sấy ở 400C đến khối lượng không đổi. Sau đó, Cân 10g bột rong (đã ủ enzyme) cho vào erlen ngâm trong hỗn hợp dung môi gồm methanol và chlorofom (2:1). Tỷ lệ rong và dung môi là 1:6. Ngâm dung môi trong 16h và tiến hành lọc để tách bã ra khỏi dịch trích. Dịch trích sẽ được tách dung môi bằng cách bốc hơi tự nhiên. Bã sẽ được đem sấy về khối lượng không đổi để tính tỷ lệ thu hồi. Thực hiện 3 lần.
- Chỉ tiêu xác định: tỷ lệ thu hồi lipid. + Bình tam giác: 100ml. + Nhiệt kế: 1000C. + Tủ sấy. + Máy đo ẩm. + Tủ ấm. + Máy xay. + Rây. + Phễu, giấy lọc. của q u á trìn h trích ly.
Bảng 2.1: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. M ẫu Yếu tố thay đôi
(kích thước)
Yếu tố cố định
1 0,25mm
- Loại dung môi (methanol:chlorofom 2:1). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1: 6. - Lượng enzyme 1%, nhiệt độ và thời gian ủ enzyme (55 ± 20C - 6h). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 0,50mm
3 0,63mm
2.3.2 Thí nghiệm 2: K hảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến q u á trìn h trích ly.- Mục đích: Chọn nồng độ enzyme để thành tế bào của rong bị phá vỡ tốt nhất giúp - Mục đích: Chọn nồng độ enzyme để thành tế bào của rong bị phá vỡ tốt nhất giúp quá trình trích ly diễn ra hiệu quả hơn.
- Tiến hành: Thí nghiệm tiến hành với mẫu rong có kích thước tốt nhất ở thí nghiệm 1 với nồng độ khảo sát: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%. Thực hiện tương tự thí nghiệm 1 và lặp lại 3 lần.
- Chỉ tiêu xác định: Tỷ lệ thu hồi.
Bảng 2.2: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. M ẫu Yếu tố thay đôi
(Nồng độ % ) Yếu tố cố định
1 0,5% - Kích thước: vừa khảo sát ở thí nghiệm 1. - Loại dung môi (methanol:chlorofom). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1: 6. - Nhiệt độ và thời gian ủ enzyme (55 ± 20C , 6h). - Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 1,0%
3 1,5%
4 2,0%
2.3.3 Thí nghiệm 3: K hảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ủ enzyme.
- Mục đích: Chọn nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động tối ưu cho hiệu suất trích ly hiệu quả.
- Tiến hành: Mẫu sử dụng là mẫu được chọn ở điều kiện tối ưu của thí nghiệm 2 và thay đổi nhiệt độ ủ enzyme. Thực hiện tương tự thí nghiệm 1 và 2. Thí nghiệm lặp lại ba lần.
+ Đối với P- glucanase: Nhiệt độ khảo sát: 350C, 450C, 550C, 650C, 750C. + Đối với Viscozyme: Nhiệt độ khảo sát: 300C, 400C, 500C, 600C, 700C.
Bảng 2.3: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. M ẫu Yêu tố thay đôi
(Nhiệt độ 0C)
Yêu tố cố định
1 35
- Kích thước: vừa khảo sát ở thí nghiệm 1. - Loại dung môi (methanol:chlorofom 2:1). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1: 6. - Nhiệt độ, thời gian ủ enzyme (55 ± 20C, 6h). - Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 45
3 55
4 65
5 75
2.3.4 Thí nghiệm 4: K hảo sát thời gian ủ enzyme.
- Mục đích: Tìm ra thời gian tối ưu để enzyme thủy phân thành tế bào trong rong nâu nâng cao hiệu suất trích ly.
- Tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành đối với hai loại enzyme p - glucanase, viscozyme tương ứng rong mơ có kích thước: 0,25mm. Rong nâu trộn với nước theo tỷ lệ rong nâu/nước (g/ml) là 1:7, nhiệt độ ủ 550C, thời gian ủ là 6 giờ. Rong sau khi ủ enzyme sẽ được sấy ở 400C đến khối lượng không đổi. Sau đó, Cân 10g bột rong (đã ủ enzyme) cho vào erlen ngâm trong hỗn hợp dung môi gồm methanol và chlorofom (2:1). Tỷ lệ rong và dung môi là 1:6. Ngâm dung môi trong 16h và tiến hành lọc để tách bã ra khỏi dịch trích. Dịch trích sẽ được tách dung môi bằng cách bốc hơi tự nhiên. Bã sẽ được đem sấy về khối lượng không đổi để tính tỷ lệ thu hồi. Thực hiện 3 lần.
- Thay đổi thời gian ủ khảo sát: 1 - 8h. - Chỉ tiêu xác định: Tỷ lệ thu hồi.
B ảng 2.4: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ ezyme đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M ẫu
Yêu tố thay đôi
(Thời gian h) Yêu tố cố định
1 1
- Kích thước: vừa khảo sát ở thí nghiệm 1. - Loại dung môi (methanol : chlorofom 2:1). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1 : 6. - Nhiệt độ, thời gian ủ enzyme (55 ± 20C, 6h). - Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
2.3.5 Thí nghiệm 4: P h ân tích th à n h phần acid béo có tro n g dịch trích lipid.- Mục đích: Xác định thành phần acid béo có trong dịch trích lipid. - Mục đích: Xác định thành phần acid béo có trong dịch trích lipid.
- Tiến hành: Gửi mẫu phân tích sắc ký khí. - Chỉ tiêu xác định: thành phần acid béo.
2.3.6 Thí nghiệm 5: K iểm tr a k h ả năng kháng oxy hóa từ dịch trích lipid thô của rong nâu. rong nâu.
- M ục đích: Xác định dịch trích lipid thô của rong nâu có thể hiện khả năng kháng oxy hóa và phần trăm bắt gốc gốc tự do của dịch trích.
- Phương pháp xác định: Phương pháp bắt gốc tự do DPPH. - Chỉ tiêu xác định: Phần trăm bắt gốc tự do của dịch trích.
2.4 Q uy trìn h đề x u ất trích ly lipid v à phân tích các ch ất kháng oxy hóa tro n g dịch trích lipid thô của rong nâu. trích lipid thô của rong nâu.
2.4.1 Quy trìn h trích ly lipid từ rong nâu.
V
-+- T huyêt m inh sơ đồ a. Rửa:
- Mục đích: Làm sạch muối, các tạp chất như cát, bùn, vi sinh vật và một số thành phần tan trong nước.
- Tiến hành: Rong được rửa làm nhiều lần ( 3 - 4 lần) trong bể nước, thời gian đầu cần ngâm rong từ 0,5 - 1h.
b. Sấy
- Mục đích: Làm giảm lượng nước trong rong, đưa nguyên liệu về khối lượng không đổi. Hỗ trợ quá trình xay, tăng tỷ lệ thu hồi dịch trích.
- Tiến hành: Rong sau khi rửa, để ráo sau đó cho vào tủ sấy 400C đến khi đạt đến độ ẩm không đổi.
c. Xay
- Mục đích: Phá vỡ cấu trúc tế bào của rong nâu, giảm kích thước nguyên liệu, tăng diện tích tiếp xúc giữa rong nâu và dung môi để hỗ trợ quá trình trích ly.
- Tiến hành: Rong sau khi sấy sẽ được đưa vào máy xay, xay nhỏ thành bột sau đó chuyển sang công đoạn tiếp theo.
d. Rây
- Mục đích: làm đồng đều kích thước, làm bột rong khuếch tán đều trong dung môi. Hỗ trợ trích ly.
- Tiến hành: Sàng có ba kích thước: 0,63mm; 0,50mm; 0,25mm. Rong sau khi xay