2.1.1 Rong nâu
- Đối tượng nghiên cứu là rong mơ nâu có tên khoa học là Sargassum feldmannii được thu mua từ Khánh Hòa, có độ ẩm ban đầu là 16%.
2.1.2 Viscozyme
- Viscozyme được sản xuất bởi một chủng chọn của nấm Aspergillus aculeatus.
- Viscozyme chứa một loạt các carbohydrases bao gồm arabanase, cellulase, beta- glucanase, hemixenlulaza, xylanase và pentosanase. Nó cũng phá vỡ các chất pectin nhánh tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Các điều kiện tối ưu cho Viscozyme là pH 7 - 8 và nhiệt độ 50 - 550C.
2.1.3 Enzym e P- glucanase
- SEBflo-TL là một endoglucanase (hay endo - P-1,4-glucanase) thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo thành oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose hoặc cellobise. Được sản xuất từ chủng Trichoderma (Claeyssens et
al.,1989)
- Endo-P -1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết p -1,4-glucosidie bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobise và glucose. Endo-P -1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.
- Nhiệt độ hoạt động ổn định của SEBflo-TL là 30 - 700C, hoạt tính enzyme giảm và ngừng hoạt động tại 700C. pH tối ưu là 4 - 6,5. Tại điểm pH thấp hơn 3 hoặc pH lớn hơn 6,5 enzyme bắt đầu ngừng hoạt động.
2.2 Phương pháp nghiên cứu.2.2.1 Phương pháp. 2.2.1 Phương pháp.
- Sấy. - Ủ enzyme.
- Đo ẩm. - Ngâm chiết.
- Xay. - Phương pháp sắc ký khí.
- Rây. - Phương pháp bắt gốc tự do DPPH.
2.2.2 H óa ch ất v à dụng cụa. H óa chất a. H óa chất
- Methanol, chloroform.
- Enzyme p - glucanase, Viscozyme. b. Dụng cụ
- Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP Hồ Chí Minh:
+ Cân điện tử: 3 số lẻ hiệu ASIX 2.3 Bố tr í th í nghiệm
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu thí nghiệm một nhân tố, mô hình bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên.
2.3.1 Thí nghiệm 1: K hảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ th u hồi
- Mục đích: Chọn ra kích thước thích hợp cho quá trình trích ly.
- Tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành đối với hai loại enzyme p - glucanase, Viscozyme tương ứng rong mơ có 3 kích thước khảo sát: 0,25mm, 0,5mm, 0,63mm. Rong nâu trộn với nước theo tỷ lệ rong nâu/nước (g/ml) là 1:7, nhiệt độ ủ 550C, thời gian ủ là 6 giờ. Rong sau khi ủ enzyme sẽ được sấy ở 400C đến khối lượng không đổi. Sau đó, Cân 10g bột rong (đã ủ enzyme) cho vào erlen ngâm trong hỗn hợp dung môi gồm methanol và chlorofom (2:1). Tỷ lệ rong và dung môi là 1:6. Ngâm dung môi trong 16h và tiến hành lọc để tách bã ra khỏi dịch trích. Dịch trích sẽ được tách dung môi bằng cách bốc hơi tự nhiên. Bã sẽ được đem sấy về khối lượng không đổi để tính tỷ lệ thu hồi. Thực hiện 3 lần.
- Chỉ tiêu xác định: tỷ lệ thu hồi lipid. + Bình tam giác: 100ml. + Nhiệt kế: 1000C. + Tủ sấy. + Máy đo ẩm. + Tủ ấm. + Máy xay. + Rây. + Phễu, giấy lọc. của q u á trìn h trích ly.
Bảng 2.1: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. M ẫu Yếu tố thay đôi
(kích thước)
Yếu tố cố định
1 0,25mm
- Loại dung môi (methanol:chlorofom 2:1). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1: 6. - Lượng enzyme 1%, nhiệt độ và thời gian ủ enzyme (55 ± 20C - 6h).
- Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 0,50mm
3 0,63mm
2.3.2 Thí nghiệm 2: K hảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến q u á trìn h trích ly.- Mục đích: Chọn nồng độ enzyme để thành tế bào của rong bị phá vỡ tốt nhất giúp - Mục đích: Chọn nồng độ enzyme để thành tế bào của rong bị phá vỡ tốt nhất giúp quá trình trích ly diễn ra hiệu quả hơn.
- Tiến hành: Thí nghiệm tiến hành với mẫu rong có kích thước tốt nhất ở thí nghiệm 1 với nồng độ khảo sát: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%. Thực hiện tương tự thí nghiệm 1 và lặp lại 3 lần.
- Chỉ tiêu xác định: Tỷ lệ thu hồi.
Bảng 2.2: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. M ẫu Yếu tố thay đôi
(Nồng độ % ) Yếu tố cố định
1 0,5% - Kích thước: vừa khảo sát ở thí nghiệm 1. - Loại dung môi (methanol:chlorofom). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1: 6. - Nhiệt độ và thời gian ủ enzyme (55 ± 20C , 6h). - Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 1,0%
3 1,5%
4 2,0%
2.3.3 Thí nghiệm 3: K hảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ủ enzyme.
- Mục đích: Chọn nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động tối ưu cho hiệu suất trích ly hiệu quả.
- Tiến hành: Mẫu sử dụng là mẫu được chọn ở điều kiện tối ưu của thí nghiệm 2 và thay đổi nhiệt độ ủ enzyme. Thực hiện tương tự thí nghiệm 1 và 2. Thí nghiệm lặp lại ba lần.
+ Đối với P- glucanase: Nhiệt độ khảo sát: 350C, 450C, 550C, 650C, 750C. + Đối với Viscozyme: Nhiệt độ khảo sát: 300C, 400C, 500C, 600C, 700C.
Bảng 2.3: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ thu hồi dịch trích. M ẫu Yêu tố thay đôi
(Nhiệt độ 0C)
Yêu tố cố định
1 35
- Kích thước: vừa khảo sát ở thí nghiệm 1. - Loại dung môi (methanol:chlorofom 2:1). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1: 6. - Nhiệt độ, thời gian ủ enzyme (55 ± 20C, 6h). - Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 45
3 55
4 65
5 75
2.3.4 Thí nghiệm 4: K hảo sát thời gian ủ enzyme.
- Mục đích: Tìm ra thời gian tối ưu để enzyme thủy phân thành tế bào trong rong nâu nâng cao hiệu suất trích ly.
- Tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành đối với hai loại enzyme p - glucanase, viscozyme tương ứng rong mơ có kích thước: 0,25mm. Rong nâu trộn với nước theo tỷ lệ rong nâu/nước (g/ml) là 1:7, nhiệt độ ủ 550C, thời gian ủ là 6 giờ. Rong sau khi ủ enzyme sẽ được sấy ở 400C đến khối lượng không đổi. Sau đó, Cân 10g bột rong (đã ủ enzyme) cho vào erlen ngâm trong hỗn hợp dung môi gồm methanol và chlorofom (2:1). Tỷ lệ rong và dung môi là 1:6. Ngâm dung môi trong 16h và tiến hành lọc để tách bã ra khỏi dịch trích. Dịch trích sẽ được tách dung môi bằng cách bốc hơi tự nhiên. Bã sẽ được đem sấy về khối lượng không đổi để tính tỷ lệ thu hồi. Thực hiện 3 lần.
- Thay đổi thời gian ủ khảo sát: 1 - 8h. - Chỉ tiêu xác định: Tỷ lệ thu hồi.
B ảng 2.4: Tóm tắt khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ ezyme đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
M ẫu
Yêu tố thay đôi
(Thời gian h) Yêu tố cố định
1 1
- Kích thước: vừa khảo sát ở thí nghiệm 1. - Loại dung môi (methanol : chlorofom 2:1). - Tỷ lệ giữa nguyên liệu: dung môi là: 1 : 6. - Nhiệt độ, thời gian ủ enzyme (55 ± 20C, 6h). - Thời gian ngâm dung môi: 16h.
2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
2.3.5 Thí nghiệm 4: P h ân tích th à n h phần acid béo có tro n g dịch trích lipid.- Mục đích: Xác định thành phần acid béo có trong dịch trích lipid. - Mục đích: Xác định thành phần acid béo có trong dịch trích lipid.
- Tiến hành: Gửi mẫu phân tích sắc ký khí. - Chỉ tiêu xác định: thành phần acid béo.
2.3.6 Thí nghiệm 5: K iểm tr a k h ả năng kháng oxy hóa từ dịch trích lipid thô của rong nâu. rong nâu.
- M ục đích: Xác định dịch trích lipid thô của rong nâu có thể hiện khả năng kháng oxy hóa và phần trăm bắt gốc gốc tự do của dịch trích.
- Phương pháp xác định: Phương pháp bắt gốc tự do DPPH. - Chỉ tiêu xác định: Phần trăm bắt gốc tự do của dịch trích.
2.4 Q uy trìn h đề x u ất trích ly lipid v à phân tích các ch ất kháng oxy hóa tro n g dịch trích lipid thô của rong nâu. trích lipid thô của rong nâu.
2.4.1 Quy trìn h trích ly lipid từ rong nâu.
V
-+- T huyêt m inh sơ đồ a. Rửa:
- Mục đích: Làm sạch muối, các tạp chất như cát, bùn, vi sinh vật và một số thành phần tan trong nước.
- Tiến hành: Rong được rửa làm nhiều lần ( 3 - 4 lần) trong bể nước, thời gian đầu cần ngâm rong từ 0,5 - 1h.
b. Sấy
- Mục đích: Làm giảm lượng nước trong rong, đưa nguyên liệu về khối lượng không đổi. Hỗ trợ quá trình xay, tăng tỷ lệ thu hồi dịch trích.
- Tiến hành: Rong sau khi rửa, để ráo sau đó cho vào tủ sấy 400C đến khi đạt đến độ ẩm không đổi.
c. Xay
- Mục đích: Phá vỡ cấu trúc tế bào của rong nâu, giảm kích thước nguyên liệu, tăng diện tích tiếp xúc giữa rong nâu và dung môi để hỗ trợ quá trình trích ly.
- Tiến hành: Rong sau khi sấy sẽ được đưa vào máy xay, xay nhỏ thành bột sau đó chuyển sang công đoạn tiếp theo.
d. Rây
- Mục đích: làm đồng đều kích thước, làm bột rong khuếch tán đều trong dung môi. Hỗ trợ trích ly.
- Tiến hành: Sàng có ba kích thước: 0,63mm; 0,50mm; 0,25mm. Rong sau khi xay sẽ qua ba sàng, nếu bột rong không lọt sàng 0,63mm sẽ được mang xay lại. Rong lọt sàng 0,63mm nhưng không lọt sàng 0,50mm sẽ thu được rong có kích thước 0,63mm. Những rong lọt sàng 0,50mm nhưng không lọt sàng 0,25mm sẽ thu được kích thước 0,50mm, lọt sàng sẽ thu được rong kích thước 0,25mm.
e. X ử lý enzyme
- Mục đích: phá vỡ cấu trúc vách tế bào, thủy phân màng tế bào bên trong và bên ngoài, thủy phân màng túi dầu làm tăng hiệu suất trích ly.
- Tiến hành: Bột rong sau khi rây sẽ trộn với nước (theo tỷ lệ 1:7). Sau đó, bổ sung enzyme a% và ủ enzyme với nhiệt độ T (0C) trong thời gian t (h). Sau đó, sấy khối bột ủ ở 400C đến khối lượng không đổi.
f. N gâm dung môi
- Mục đích: Tách lipid và hợp chất tan trong lipid từ rong nâu vào dung môi.
g. Lọc
- Mục đích: Nhằm mục đích tách cặn bã của nguyên liệu với phần dung môi dịch cần trích ly.
- Khi thời gian trích ly kết thúc, dùng giấy lọc để tách bã và dịch trích, lọc bã nhiều lần bằng dung môi.
h . Tách dung môi.
- Mục đích: thu dịch trích lipid thô.
- Tiến hành: Dựa vào sự chênh lệch nhiệt độ sôi của dung môi và dịch cần trích để tách dung môi ra khỏi dịch cần trích ly.
2.4.2 P h ân tích k h ả năng kháng oxy hóa v à th à n h ph ần acid béo tro ng dịch trích lipid thô của rong nâu. lipid thô của rong nâu.
H ình 2.2: Sơ đồ phân tích dịch trích lipid thô của rong nâu.
- M ục đích: xác định khả năng kháng oxy hóa và các thành phần acid béo có trong dịch trích.
- Tiên h ành: Sau khi thu hồi dịch trích từ quá trình trích ly, thu được lipid thô sẽ gửi mẫu đi phân tích để xác định khả năng kháng oxy hóa và các thành phần acid béo có trong dịch trích.
CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ BIỆN LUẬN
3.1 K hảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ th u hồi của dịch trích.
- Thí nghiệm được tiến hành đối với mẫu rong mơ, được xay đến 3 kích thước khác nhau là: 0,25mm, 0,50mm, 0,63mm dưới tác dụng thủy phân của 2 loại enzyme: p -
glucanase và Viscoenzyme cùng nồng độ, được ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 giờ trong cùng một điều kiện trích ly.(xem chương 2, phần 2.3.1). Ta có kết quả sau:
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
Enzym e K ích thước (mm) 0,25 0,50 0,63 p - glucanase 9,38 9,31 9,25 9,32 9,27 9,11 9,43 9,37 9,19 Viscozyme 9,41 9,34 9,24 9,33 9,28 9,16 9,45 9,39 9,21
- Từ kết quả trên, xử lý thống kê ta có ta có được kết quả phân tích phương sai ANOVA sau:
Bảng 3.2: Kết quả xử lý ANOVA và LSD khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ thu hồi dịch trích có hỗ trợ của enzyme p - glucanase.
ANOVA Table for TYLETHUHOI by KICHTHUOC
Analysis of Variance
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 0,0587556 2 0,0293778 8,39 0,0183
Within groups 0, 021 6 0,0035
Multiple Range Tests for TYLETHUHOI by KICHTHUOC Method: 95.
KICHTHUOC
. 0 percent LSD
Count Mean Homogeneous Groups
0,63 3 9,18333 X
0,50 3 9,31667 X
0,25 3 9,37667 X
Bảng 3.3: Kết quả xử lý ANOVA và LSD khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ thu hồi dịch trích có hỗ trợ của Viscozyme.
ANOVA Table for TYLETHUHOI1 by KICHTHUOC
Analysis of Variance
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 0,0587556 Within groups 0,0168 2 6 0,0293778 0,0028 10,49 0,0110 Total (Corr.) 0,0755556 8
Multiple Range Tests for TYLETHUHOI by KICHTHUOC Method: 95.0 percent
KICHTHUOC Count
LSD
Mean Homogeneous Groups
0,63 3 0,50 3 9,20333 9,33667 X X 0,25 3 9,39667 X
- Qua kết quả phân tích phương sai ANOVA ta có kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ thu hồi dịch trích.
Bảng 3.4: Kết quả sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến tỷ lệ thu hồi dịch trích lipid của rong nâu.
Enzyme
Kích thước (mm)
0,25 0,50 0,63
p - Glucanase 9,377a 9,317a 9,183b
Viscoenzyme 9,397a 9,337a 9,203C
- Qua bảng kết quả phân tích phương sai ANOVA (phụ lục bảng 1.2 và 2.2), cho thấy kích thước nguyên liệu có ảnh hưởng đến tỷ lệ thu hồi của dịch trích rong nâu ở độ tin cậy 95% (P < 0,05)
- Qua bảng LSD ta thấy, giữa các cặp kích thước có ảnh hưởng đến tỷ lệ thu hồi của dịch trích. Kích thước càng nguyên liệu càng lớn thì dịch trích thu được càng giảm. Mẫu rong kích thước 0,25mm cho tỷ lệ thu hồi cao nhất (kích thước 0,25mm cho tỷ lệ thu hồi 9,377% đối với enzyme p - glucananse và 9,397% đối với Viscoenzyme). Việc xay nhỏ nguyên liệu góp phần phá vỡ vách tế bào, tạo điều kiện cho chất tan thoát ra ngoài và enzyme tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn. Tuy nhiên, không có khác biệt giữa mẫu kích thước 0,25mm và 0,5mm ở mức ý nghĩa thống kê 5%. Có thể ở kích thước 0,25mm các hạt mịn nằm khít chặt nhau giảm diện tích bề mặt tiếp xúc, khả năng thẩm thấu vào bên trong khối hạt mịn không đồng đều nên kích thước có giảm thì quá trình trích ly tăng không đáng kể.
- Mức độ cơ học hay lý học cùa các mô ảnh hưởng ngược lại trên hiệu suất trích ly. Với cấu trúc tế bào bị phá vỡ hoàn toàn, các phân tử có thể tiếp xúc hoàn toàn với dung môi (Kitrigin, 1976). Nguyên liệu có kích thước càng nhỏ thì quá trình trao đổi trên bề mặt cũng như hòa tan trên bề mặt dễ thực hiện hơn. Cấu trúc tự nhiên của nguyên liệu (thực vật), đặc biệt màng tế bào chất và thành tế bào sẽ cản trở sự khuếch tán bởi cấu trúc bên trong hạt, cản trở quá trình trích ly. Do đó, việc xay nguyên liệu làm thay đổi cấu trúc hạt, làm hạt giãn nở ra, có cấu trúc xốp hơn, tăng khả năng khuếch tán của các chất tan vào dung môi.
- Chất hòa tan nằm trong hệ vật có cấu trúc rắn chắc thì giảm kích thước để chất tan dễ tiếp xúc với các dung môi. Tuy nhiên, độ mịn của các phân tử cũng phải có giới hạn, khi