3.3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc đến sự tổng hợp pectin methylesterase
3.3.1.1 Mục đích
Xác định độ ẩm và thời gian nuôi cấy thích hợp nấm mốc sinh pectin methylesterase có hoạt tính cao nhất.
3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố đƣợc khảo sát và ba lần lặp lại.
+ Nhân tố A: Độ ẩm môi trƣờng, thay đổi ở 4 mức độ
A1: 50% A2: 55% A3: 60% A4: 65%
+ Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy
B1: 42 giờ B2: 66 giờ B3: 90 giờ B4: 114 giờ
Số nghiệm thức là: 4 4 = 16
Số mẫu thí nghiệm: 16 3 = 48 mẫu
3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy có khối lƣợng là 10 g (70% cám + 25% trấu + 5% bột mì) cho mỗi mẫu thí nghiệm. Tiến hành điều chỉnh độ ẩm bằng nƣớc cất đến các mức độ ẩm khác nhau theo khảo sát. Môi trƣờng đƣợc xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến hành nuôi cấy Aspergillus niger (5 × 102 cfu/mL). Ứng với các mức thời gian ủ khác nhau, lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát độ ẩm và thời gian nuôi cấy nấm mốc
A1 A2 A3 A4
B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121 o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
3.3.1.4 Kết quả thu nhận
, từ đó xác định đƣợc độ ẩm môi trƣờng thích hợp và thời gian lên men
.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc đến khả năng sinh tổng hợp pectinmethylesterase
3.3.2.1 Mục đích
Xác định điều kiện pH môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase đạt hiệu quả cao.
3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố C: pH môi trƣờng C0: Đối chứng (pH = 5,8) C1: pH = 4 C2: pH = 4,5 C3: pH = 5 C4: pH = 5,5 C5: pH = 6 C6: pH = 6,5 Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm: 7 3 = 21 mẫu
3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mỗi mẫu thí nghiệm có khối lƣợng là 10 g. Sử dụng các thông số tối ƣu ở
thí nghiệm 1 (thời gian và độ ẩm) để tiến hành thực hiện điều chỉnh pH của môi
trƣờng nuôi cấy. Sử dụng dung dịch đệm citrat ở các mức pH khác nhau để điều
chỉnh pH môi trƣờng lên men. Nguyên liệu đƣợc xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến
hành nuôi Aspergillus niger (5 × 102 cfu/mL) với các khoảng pH môi trƣờng khác
nhau theo cùng một độ ẩm và khoảng thời gian tối ƣu. Sau đó lọc môi trƣờng với
nƣớc cất và thu nhận enzyme.
3.3.2.4 Kết quả thu nhận
Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME (U/mL) tƣơng ứng với điều kiện pH môi trƣờng khác nhau.
Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc
3.3.3 Thí nghiệm 3: Tác động của thành phần đạm bổ sung đến khả năng sinh pectinmethylesterase từ Aspergillus niger sinh pectinmethylesterase từ Aspergillus niger
3.3.3.1 Mục đích
Tìm ra loại đạm bổ sung thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME từ nấm mốc
A.niger đạt hiệu quả cao nhất. 3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố D: Thành phần đạm bổ sung
D0: Đối chứng (không bổ sung đạm)
D1: (NH4)2SO4 0,1%
D2: (NH4)2HPO4 0,1% Số nghiệm thức: 3
Số mẫu thí nghiệm: 33 = 9 mẫu
C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Độ ẩm tối ƣu theo kết quả thí nghiệm 1
Thời gian ủ thích hợp theo kết quả thí nghiệm 1
Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khoáng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc
3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mỗi mẫu thí nghiệm có khối lƣợng là 10 g. Sử dụng các thông số tối ƣu ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (pH, độ ẩm môi trƣờng thích hợp) để tiến hành bổ sung đạm vào môi trƣờng nuôi cấy. Làm mát môi trƣờng sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2mL huyền phù bào tử nấm mốc vào mỗi bình cấy (5 × 102
cfu/mL) và ủ ở nhiệt độ phòng theo thời gian ủ đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm 1. Sau đó lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
.
3.3.3.4 Kết quả thu nhận
Hoạt tính PME (U/mL) tƣơng ứng với từng nghiệm thức thí nghiệm.
Xác định các điều kiện cơ bản cho quá trình lên men sinh PME từ A.niger trên môi
trƣờng cơ bản (cơ chất cảm ứng bột mì).
D0 D1 D2 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Độ ẩm tối ƣu theo kết quả TN 1 pH môi trƣờng thích hợp theo TN 2
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Quá trình trích ly PME từ nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều các thông số nhƣ điều kiện nuôi cấy, lên men; tỷ lệ pha loãng của cơ chất, điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian ủ cũng nhƣ tác động của các thành phần khoáng và phụ gia nhƣ Nitrogen, các muối MgSO4, MnSO4, NaCl và FeCl3 …(Berovic et al., 1993; Schmitz, 2002; Hamdy, 2005; Joshi et al., 2006). Hiệu quả trích ly cũng nhƣ hoạt tính của PME sẽ đƣợc cải thiện khi các thông số trên đƣợc thực hiện ở giá trị tối ƣu. Chính vì thế, quá trình lên men sinh enzyme PME cần phải đƣợc khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng và cơ chất, điều kiện môi trƣờng lên men.
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY A.NIGER ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTINMETHYLESTERASE CẤY A.NIGER ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTINMETHYLESTERASE
Tiến hành nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger ở các môi trƣờng có độ ẩm khác
nhau, tƣơng ứng với từng khoảng thời gian ủ, trích ly và đo hoạt tính PME (U/mL). Kết quả đƣợc tổng hợp và thể hiện ở bảng 4.
Bảng 4: Hoạt tính PME (U/mL) thu đƣợc theo độ ẩm môi trƣờng và thời gian nuôi cấy
Thời gian (giờ) Độ ẩm (%) Hoạt tính PME trung bình (U/mL)
42 50 15,758 ± 2,799 55 31,256 ± 5,875 60 32,598 ± 6,379 65 34,213 ± 5,727 66 50 12,574 ± 3,241 55 60,130 ± 5,067 60 44,113 ± 6,856 65 32,598 ± 5,657 90 50 21,111 ± 3,615 55 62,797 ± 5,819 60 47,031 ± 3,789 65 39,549 ± 5,728 114 50 36,075 ± 5,864 55 39,816 ± 5,167 60 35,273 ± 5,094 65 31,532 ± 2,816
Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng (Lê Xuân Phương, 2004), vì vậy nếu độ ẩm môi trƣờng không thích hợp thì vi sinh vật
sẽ khó tiếp nhận thức ăn, nên không phát triển đƣợc làm kìm hãm sự tổng hợp enzyme. Ngoài ra, hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào sự phát triển của tế bào nấm mốc. Thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzyme thu cao hay thấp.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 42 66 90 114
Thời gian ủ (giờ)
Ho ạt tí nh PM E ( U/m L) Độ ẩm MT 50% Độ ẩm MT 55% Độ ẩm MT 60% Độ ẩm MT 65%
Hình 10: Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng lên men và thời gian ủ đến hiệu quả sinh PME từ A.niger
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4 và hình 10 cho thấy khả năng sinh PME từ A.niger trên môi trƣờng trấu, cám và bột mì chịu sự chi phối cả ở độ ẩm
môi trƣờng và thời gian ủ.
Với độ ẩm môi trƣờng lên men thấp (50%), nƣớc cung cấp không đủ cho các phản ứng sinh lý, sinh hóa bên trong nấm mốc, gây cản trở sự sinh trƣởng và phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004), chính vì thế hoạt tính PME thu đƣợc tƣơng ứng với mức độ ẩm này thấp hơn hẳn khi so sánh với PME thu đƣợc từ môi trƣờng nuôi cấy có độ ẩm cao hơn (55, 60 và 65%), trừ trƣờng hợp PME đƣợc trích ly sau 5 ngày hay 114 giờ ủ. Ở mức độ ẩm thấp, nấm mốc cần thời gian dài hơn để có thể thích nghi với điều kiện môi trƣờng, gia tăng mật số và sinh tổng hợp PME (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004; Joshi, 2006). Chính vì thế, hoạt tính PME khi lên men ở độ ẩm môi trƣờng 50% tăng dần theo thời gian lên men và đạt giá trị cao nhất sau 5 ngày lên men (36,075 ± 5,864 U/mL) ở cùng điều kiện. Tuy nhiên, giá trị hoạt tính này vẫn khá thấp hơn so với PME thu đƣợc ở các chế độ khảo sát độ ẩm môi trƣờng từ 55 đến 65%.
Nhìn chung, thời gian ủ tối ƣu để sinh PME từ A.niger là 90 giờ khi độ ẩm môi
trƣờng lên men thay đổi từ 55 đến 65%. Ngay sau khi nuôi cấy 42 giờ, nấm mốc chƣa gia tăng mật số, đây là thời gian chúng làm quen với môi trƣờng sống và chuẩn bị cho sự tăng trƣởng vƣợt bậc, nên thời điểm này là quá sớm để thu nhận
enzyme. Bắt đầu từ sau 42 giờ, nấm mốc đã thích nghi với môi trƣờng, dinh dƣỡng vẫn còn đảm bảo cho quá trình phát triển, do vậy mật số đƣợc nhân lên với tốc độ rất nhanh, quá trình này diễn ra đồng thời với lƣợng enzym đƣợc tổng hợp ngày càng nhiều. Từ sau 60 giờ nuôi cấy, sự phát triển của nấm mốc bắt đầu chậm lại, lƣợng enzyme tổng hợp đƣợc cũng giảm do lƣợng dinh dƣỡng trong môi trƣờng đã bị nấm mốc sử dụng trong các quá trình phát triển sinh khối. Đến 90 giờ, lƣợng enzyme thu đƣợc là nhiều nhất. Tuy nhiên, đây cũng là thời gian nấm mốc bắt đầu sinh bào tử. Do môi trƣờng đã không đủ dinh dƣỡng, mật số nấm mốc cao là điều kiện bất lợi cho nấm mốc phát triển và tổng hợp PME. Theo nghiên cứu của Aguilar và Huitron (1990); Galiotou-Panayotou và Kapantai, (1993); Solis-Pereyra
et al., (1993); Taragano et al., (1997) cũng cho thấy, thời gian ủ tối ƣu cho quá
trình lên men rắn A.niger sinh PME thay đổi trong khoảng 90 đến 120 giờ. Vì vậy, ở 90 giờ là thời điểm tốt nhất để thu chế phẩm enzyme. Nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy thì hoạt tính enzyme thu đƣợc sẽ giảm đáng kể.
Hoạt tính PME sau 90 giờ ủ ở độ ẩm môi trƣờng 55% cho giá trị cao nhất (62,797 ± 5,819 U/mL) khi so sánh với giá trị thu đƣợc ở độ ẩm cao hơn 60 và 65% (hoạt tính PME lần lƣợt là 47,031 ± 3,789 U/mL và 39,549 ± 5,728 U/mL). Môi trƣờng lên men có độ ẩm 55% có mức độ thoáng khí cao nên sự trao đổi ẩm và nhiệt độ trong quá trình phát triển nấm mốc thuận lợi hơn. Môi trƣờng có ẩm độ cao (60%, 65%) thì mức độ thoáng khí thấp do môi trƣờng bị dính ƣớt làm nấm mốc chậm phát triển.
Nhƣ vậy, khi nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất cảm ứng bột mì với độ ẩm môi trƣờng 55% là thông số tối ƣu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinmethylesterase, hoạt tính enzyme thu đƣợc cao nhất sau 90 giờ ủ ở nhiệt độ phòng.
4.2 ẢNH HƢỞNG pH MÔI TRƢỜNG ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTINMETHYLESTERASE
Thực hiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger trên các môi trƣờng có pH khác
nhau, ở cùng độ ẩm 55%. Sau thời gian ủ tối ƣu đƣợc xác định từ thí nghiệm 1 (90 giờ), trích ly PME và đo hoạt tính enzyme thu đƣợc.
Kết quả thống kê sự thay đổi hoạt tính của PME ở các điều kiện pH môi trƣờng đƣợc thể hiện ở bảng 5.
Bảng 5: Hoạt tính PME trung bình theo pH môi trƣờng nuôi cấy
pH dung dịch đệm Hoạt tính PME trung bình (U/mL) Đối chứng (5,8) 4 4,5 5 5,5 6 6,5 62,797bc ± 5,819 52,750a ± 2,100 56,491ab ± 5,131 78,196d ± 3,562 70,119c ± 3,340 65,042c ± 3,119 64,507c ± 5,751
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại
Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại.
64.51c 65.04c 70.12c 78.20d 56.49ab 52.75a 62.80bc 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Đối chứng pH 4.0 pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH môi trường H o ạ t tí n h P M E ( U /m L )
Hình 11: Đồ thị biểu thị hoạt tính PME trung bình theo pH môi trƣờng nuôi cấy
Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 5 và hình 11 cho thấy pH của dung dịch đệm bổ sung trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 4,0 và 4,5 thì hoạt tính trung bình của PME thu đƣợc thấp (52,750 U/mL và 56,491 U/mL), thậm chí thấp hơn so với mẫu đối chứng (điều chỉnh pH môi trƣờng bằng nƣớc cất, 62,797 U/mL). Khi sử dụng dung dịch đệm citrate để điều chỉnh pH môi trƣờng nuôi cấy đến các giá trị 5,0; 5,5; 6,0 và 6,5 thì hoạt tính của PME đƣợc cải thiện và hoạt tính trung bình của PME thu đƣợc cao nhất khi nuôi cấy nấm mốc A.niger ở pH môi trƣờng là 5,0.
Điều kiện pH môi trƣờng ảnh hƣởng rất nhiều đến khả năng tổng hợp enzyme của nấm mốc Aspergillus niger trong quá trình nuôi cấy. Môi trƣờng có pH quá thấp
hay quá cao đều không thuận lợi cho nấm mốc phát triển và tổng hợp PME. Ở môi trƣờng có pH = 4 và pH = 4,5, nồng độ các ion H+
đối cao, gây ức chế khả năng sinh PME của nấm mốc. Còn môi trƣờng có các giá trị pH từ khoảng 5,5 ÷ 6,5, nồng độ các ion H+
trong môi trƣờng nuôi cấy không cao nhƣng nấm mốc vẫn sinh PME có hoạt tính không bằng môi trƣờng có các giá trị pH = 5.
Tóm lại, pH 5,0 là thông số phù hợp cho quá trình lên men sinh PME hoạt tính cao nhất ở độ ẩm môi trƣờng 55% và thời gian ủ 90 giờ.
4.3 ẢNH HƢỞNG NGUỒN ĐẠM BỔ SUNG ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTIN METHYLESTERASE TỪ A.NIGER PECTIN METHYLESTERASE TỪ A.NIGER
Bên cạnh các thông số về độ ẩm, pH, thời gian lên men, hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp PME còn chịu sự tác động của thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng lên men. Thành phần đạm là một trong nguồn dinh dƣỡng quan trọng nhất đối với hoạt
động của nấm mốc, lên men sinh enzyme (Joshi, 2006; P , 2006).
Amonium sulfate, diamonium hydrophosphate là hai thành phần đạm bổ sung phổ biến đƣợc sử dụng cho quá trình lên men sinh PME từ các chủng vi sinh vật khác nhau (Schmitz, 2002; Joshi, 2006; , 2006). Chính vì thế, nghiên cứu chọn lựa thành phần đạm bổ sung phù hợp nhằm gia tăng hoạt tính A.niger
PME đƣợc thực hiện.
Nấm mốc A.niger đƣợc lên men ở điều kiện độ ẩm môi trƣờng 55%, pH 5,0 và thời gian ủ 90 giờ ở nhiệt độ phòng. Hai thành phần đạm (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 đƣợc bổ sung với tỉ lệ 0,1%, hoạt tính PME của hai mẫu có bổ sung đạm và mẫu đối chứng đƣợc đo đạc và thống kê. Kết quả thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6: So sánh ảnh hƣởng của thành phần đạm bổ sung đến sự thay đổi hoạt tính PME
Thành phần đạm Hoạt tính PME trung bình (U/mL) Đối chứng (NH4)2SO4 0,1% (NH4)2HPO4 0,1% 78,196a ± 3,561 177,895c ± 12,859 114,686b ± 12,534
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại
Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy hoạt tính PME thu đƣợc khi nuôi cấy nấm
mốc A.niger trong môi trƣờng có bổ sung 0,1% đạm có nguồn gốc từ (NH4)2HPO4
có cải thiện (114,686 U/mL) so với mẫu đối chứng (không bổ sung đạm, 78,196
U/mL). Hoạt tính trung bình của PME thu đƣợc cao nhất khi tiến hành nuôi cấy
nấm mốc A.niger trong môi trƣờng có bổ sung 0,1% đạm có nguồn gốc từ
114.69b 177.89c 78.20a 0 40 80 120 160 200 240
Đối chứng (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4
Thành phần đạm bổ sung
