2.4.1.1 Nguyên liệu
Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thƣờng là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm. Trong các loại nguyên liệu trên thì cám gạo, cám mì thƣờng đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại cám này có đầy đủ chất dinh dƣỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Tuy nhiên loại tinh bột của cám là tinh bột của gạo nên chúng rất dễ tạo ra sự kết dính khi ta tiến hành gia nhiệt trong quá trình thanh trùng (ngăn chặn sự chuyển vận oxy trong khối môi trƣờng) (Schmitz, 2002; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, ngƣời ta thƣờng cho thêm trấu với lƣợng khoảng 20 ÷ 25%. Thực chất, việc cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trƣờng, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lƣu thông trong lòng môi trƣờng. Nguồn dinh dƣỡng bổ sung thƣờng là các muối amonium, phosphat,… (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme pectinase, thƣờng cho vào môi trƣờng bột cà rốt (bột cà rốt chứa nhiều pectin) nhƣ chất cảm ứng để làm tăng quá trình tổng hợp enzyme này.
Bảng 2: Thành phần dinh dƣỡng của cám Thành phần Đơn vị tính Khối lƣợng Protein Lipit Gluxit Cellulose Tro Calci Photpho Sắt Vitamin B1 % % % % % mg/100g mg/100g mg/100g mg/100g 12,2 22,7 40,3 6,3 6,5 30,0 4,6 14,0 0,96
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002
2.4.1.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Trong quá trình chuẩn bị môi trƣờng, điều quan trọng nhất là tạo đƣợc độ ẩm thích hợp. Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trƣờng cám là 60%. Độ ẩm vƣợt quá 60% thƣờng tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Nếu độ ẩm nhỏ hơn 60% (thƣờng 45 ÷ 50%) thƣờng gây hiện tƣợng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, và nhƣ vậy enzyme thu sẽ giảm hoạt tính rất mạnh.
Sau khi chuẩn bị xong môi trƣờng, tiến hành thanh trùng môi trƣờng để tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm vào môi trƣờng mà có thể ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thƣờng, môi trƣờng sẽ đƣợc thanh trùng bằng hơi nƣớc nóng ở 121 oC trong thời gian 15 ÷ 30 phút.
Môi trƣờng nuôi cấy sẽ đƣợc trải đều vào các khay và tiến hành trộn giống vi sinh vật vào khối môi trƣờng sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme vào khoảng 36 ÷ 60 giờ.
(Schmitz, 2002; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.4.2 Giống vi sinh vật
Enzyme pectin methylesterase từ vi sinh vật đƣợc sản xuất dƣới nhiều dạng khác nhau nhƣ dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể. Tuy nhiên, chúng đều đƣợc sản xuất bằng hai phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt và phƣơng pháp nuôi cấy chìm. PME có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn.
Nấm sợi Aspergillus niger là một trong những chủng nấm mốc thƣờng sử dụng phổ biến cho sản xuất pectinase, đặc biệt là pectin methylesterase (Schmitz, 2002; Patil and Dayanand, 2006; Solis – Pereyra et al., 1996; Taragano et al., 1997).
2.4.3 Phƣơng pháp nuôi cấy
Để nuôi cấy nấm Aspergillus niger sản xuất enzyme PME, cả hai phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt với môi trƣờng rắn và nuôi cấy chìm đều đƣợc áp dụng (Patil and Dayanand, 2006; Solis – Pereyra et al., 1993). Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là
phƣơng pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thƣờng, môi trƣờng dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dƣỡng khác (amonium sulfate, amonium chloride, amonium phosphate).
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng rắn khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
* Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trƣơng nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi.
+ Nhiệt độ tăng rất chậm
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa + Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi
+ Khối môi trƣờng còn rời rạc
+ Enzyme mới bắt đầu đƣợc hình thành.
* Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài khoảng 14 ÷ 18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có thể nhìn rõ đƣợc sợi nấm
+ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt + Độ ẩm môi trƣờng giảm dần
+ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể đạt tới 40 ÷ 45 o C
+ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi + Các enzyme đƣợc hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn
+ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh là tốt nhất.
Hình 5: Sự phát triển của nấm sợi trong nuôi cấy bề mặt
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002)
* Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ÷ 20 giờ. Lúc này nhiệt độ khối môi trƣờng sẽ giảm dần kéo theo cƣờng độ hô hấp giảm một cách rõ rệt. Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trƣng. Bào tử đƣợc hình thành nhiều nên lƣợng enzyme sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm thu nhận enzyme là hết sức cần thiết (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
2.4.4 Thu nhận enzyme
Kết thúc quá trình nuôi cấy thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng. Tùy theo mục đích sử dụng, có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trƣờng hợp cần thiết khác, quá trình tinh sạch enzyme cần đƣợc áp dụng. Khi enzyme đƣợc tách hết nƣớc, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trƣờng và chúng ở dạng tinh thể, thu đƣợc chế phẩm enzyme sạch (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.4.5 Kỹ thuật sản xuất pectinmethylesterase
2.4.5.1 Quy trình kỹ thuật sản xuất enzyme pectinmethylesterase
Thời gian (giờ) Sinh khối Enzyme Nhiệt độ Chất dinh dƣỡng
Hình 6: Sơ đồ quá trình sản xuất enzyme bằng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002) 2.4.5.2 Thuyết minh quy trình
* Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy bề mặt của vi sinh vật tạo enzyme pectinmethylesterase gồm có 60 ÷ 70% là bột cám, 20 ÷ 25% trấu, nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng tổng hợp enzyme pectinase tƣơng ứng là 5 ÷ 10% bột mì và bổ sung amonium sulfate và amonium chloride 1%, amonium phosphate 2%. Độ ẩm môi trƣờng là 60 ÷ 65% . Đem môi trƣờng thanh trùng ở 121 o
C trong vòng 15 phút. Sau khi thanh trùng, môi trƣờng đƣợc làm nguội xuống nhiệt độ phòng và bắt đầu cấy giống vi sinh vật là Aspergillus niger vào môi trƣờng đã đƣợc trộn đều, trải mỏng trên khay.
* Nuôi cấy vi sinh vật
Tiến hành nuôi nấm sợi trong tủ ấm ổn định ở nhiệt độ khoảng 37 o
C. Trong khoảng 36 giờ thì kết thúc quá trình nuôi. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme đƣợc tạo ra nhiều nhất. Đây là giai đoạn thích hợp cho việc thu nhận chế phẩm enzyme thô (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2003).
Chế phẩm enzyme thô Môi trƣờng
Hấp thanh trùng
Làm nguội
Sấy kết tủa
Chế phẩm enzyme tinh khiết Ly tâm
Lọc Trích ly Nuôi cấy vi sinh vật
Nghiền và bảo quản
* Trích ly enzyme
Chiết tách enzyme từ môi trƣờng rắn ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính,… có thể chiết tách đƣợc 90 ÷ 95% và trong nƣớc chiết không chứa tạp chất không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít formalin hoặc chất sát trùng khác. Chiết tách enzyme ngƣời ta dùng nƣớc (25 ÷ 28 oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nƣớc bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trƣờng, đẩy một lƣợng lớn nƣớc. Vì vậy các enzyme, cũng nhƣ các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nƣớc dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn - nƣớc phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein.
Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3 ÷ 5 oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60 ÷ 70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5 ÷ 5,6 bằng (NH4)2SO4 600g/L.
Khi kết tủa bằng ethanol, chế phẩm enzyme thu đƣợc có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu dùng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Khi kết tủa bằng ammonium sulfat có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu đƣợc chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hòa là 0,9 ÷ 1 thì sẽ thu đƣợc chế phẩm chỉ chứa pectin transeliminase và exo - polygalacturonase.
* Ly tâm
Trong công nghệ enzyme, phƣơng pháp ly tâm thƣờng đƣợc ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan.
Khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nƣớc, protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tƣợng biến tính của enzyme, thƣờng tiến hành ly tâm lạnh (3 ÷ 5 o
C). (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002; Schmitz, 2002). * Sấy kết tủa
Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nƣớc. Để dễ bảo quản, tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp hơn 40 o
C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 ÷ 8%.
* Nghiền và bảo quản
Sau khi sấy, enzyme đƣợc nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín (chai lọ hoặc túi polyetylen), bảo quản ở nhiêt độ lạnh.
Chế phẩm enzyme này gọi là chế phẩm dạng rắn thô. M uốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tinh chế.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.4.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp pectin methylesterase
Sự tổng hợp PME phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau trong suốt quá trình nuôi cấy cũng nhƣ tổng hợp enzyme. Việc đo lƣờng hoạt tính đã chỉ ra sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các điều kiện nuôi cấy khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau của PME (Bordenave và Goldberg, 1993).
2.4.6.1 Môi trường nuôi cấy
Trên từng loại nguyên liệu khác nhau, khả năng sinh PME cũng khác nhau, ngay cả các mô khác nhau trên cùng một loại nguyên liệu cũng có ảnh hƣởng lớn đến quá trình tổng hợp của Aspergillus niger.
2.4.6.2 Độ ẩm
Độ ẩm cao sẽ làm môi trƣờng dễ kết dính, ảnh hƣởng đến độ thoáng khí. Ngƣợc lại, độ ẩm môi trƣờng thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi cũng nhƣ khả năng tạo enzyme.
2.4.6.3 Nhiệt độ
Nấm mốc Aspergillus niger phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 30 oC. Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme.
2.4.6.4 pH
Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt thƣờng ít ảnh hƣởng do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme.
2.4.6.5 Thời gian ủ
Thời gian nuôi để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tƣợng không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử
2.5 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PECTINMETHYLESTERASE 2.5.1 Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang 2.5.1 Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang
Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nƣớc trái cây và rƣợu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất này nằm ở thành tế bào đƣợc phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nƣớc quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật.
Việc thu nhận nƣớc quả từ trƣớc đến nay chủ yếu bằng phƣơng pháp ép. Nếu pectin còn nhiều sẽ theo vào nƣớc quả gây ra hiện tƣợng nƣớc quả bị đục, có độ keo cao và rất khó lọc trong.
2.5.1.1 Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả
Trong tế bào của quả nƣớc chiếm khoảng 90 ÷ 95%. Nếu chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận đƣợc khoảng 60 ÷ 70% là tối đa. Bởi vì khi nghiền ép, trong phần nƣớc quả thu đƣợc sẽ kéo theo lƣợng lớn thịt quả, chủ yếu là pectin. Pectin là thành phần quan trọng của vách tế bào có nhiệm vụ bảo vệ các thành phần bên trong tế bào, giữ dịch bào trong tế bào không thoát ra.
Việc bổ sung enzyme pectinesterase sẽ giúp tăng hiệu suất ép 15 ÷ 30%, thậm chí đến 50%, nhờ vào tác động thủy phân của PME lên pectin của vách tế bào làm dịch bào thoát ra. Lúc đầu PME sẽ phân cắt nhóm methyl của pectin tạo điều kiện cho hoạt động của enzyme polygalacturonase (PG). Polygalacturonase sẽ phân cắt chuỗi pectin thành các đoạn ngắn hơn.
Trong sản xuất nƣớc quả từ nho, do nho là loại quả chứa nhiều dịch và đƣờng, trong thịt quả có chứa nhiều pectin vì vậy dễ gây đục hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thƣờng không có hiệu suất cao. Chính vì thế ngƣời ta phải xử lí nƣớc nho bằng chế phẩm enzyme. Lƣợng enzyme sử dụng trong trƣờng hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lƣợng nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đã làm nát, ngƣời ta cũng xử lý enzyme với liều lƣợng 0,2% so với khối lƣợng nho. Thời gian xử lí bằng enzyme là 3 giờ ở nhiệt độ 45 oC. Bằng phƣơng pháp xử lí này ngƣời ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3% đối với nho trắng và từ 66 lên 82,2% đối với nho đỏ (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004). Trong sản xuất nƣớc táo và nƣớc quả vải, sử dụng enzyme sẽ làm tăng hiệu suất tách dịch quả lên 20 ÷ 25%. Hoạt động chính của enzyme endo – polygalacturonase, pectimetylesterase và pectin lyase giúp quá trình ép là thủy phân các khung xƣơng chính của pectin, phá
vỡ thành tế bào làm các tế bào khó liên kết lại với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Khi xử lý nƣớc quả bằng enzyme đối với nƣớc táo, ngƣời ta thƣờng cho thêm ascorbic acid vào để chống quá trình oxy hoá. Trong sản xuất nƣớc táo, khi sử dụng chế phẩm pectinase đã mang lại hiệu quả cao.
Bên cạnh việc sử dụng enzyme để thuỷ phân pectin làm tăng hiệu suất thu hồi khi ép lấy dịch quả thì sự thuỷ phân một phần tế bào bởi enzyme cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cải thiện chất lƣợng cảm quan của dịch quả. Hoạt động thủy phân pectin bởi enzyme đã đƣợc ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt nƣớc trái c ây vì thế làm tăng nồng độ các thành phần chất chiết.
Khi sử dụng PME cần lƣu ý là hoạt động của PME cũng sẽ bị ức chế bởi nồng độ cao của đƣờng. Khi nƣớc ép cô đặc đến 60 oBrix enzyme sẽ không hoạt động nhƣng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nƣớc).
Lên men cà phê và ca cao cũng là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong quá trình lên men, lớp chất
