Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nƣớc trái cây và rƣợu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất này nằm ở thành tế bào đƣợc phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nƣớc quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật.
Việc thu nhận nƣớc quả từ trƣớc đến nay chủ yếu bằng phƣơng pháp ép. Nếu pectin còn nhiều sẽ theo vào nƣớc quả gây ra hiện tƣợng nƣớc quả bị đục, có độ keo cao và rất khó lọc trong.
2.5.1.1 Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả
Trong tế bào của quả nƣớc chiếm khoảng 90 ÷ 95%. Nếu chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận đƣợc khoảng 60 ÷ 70% là tối đa. Bởi vì khi nghiền ép, trong phần nƣớc quả thu đƣợc sẽ kéo theo lƣợng lớn thịt quả, chủ yếu là pectin. Pectin là thành phần quan trọng của vách tế bào có nhiệm vụ bảo vệ các thành phần bên trong tế bào, giữ dịch bào trong tế bào không thoát ra.
Việc bổ sung enzyme pectinesterase sẽ giúp tăng hiệu suất ép 15 ÷ 30%, thậm chí đến 50%, nhờ vào tác động thủy phân của PME lên pectin của vách tế bào làm dịch bào thoát ra. Lúc đầu PME sẽ phân cắt nhóm methyl của pectin tạo điều kiện cho hoạt động của enzyme polygalacturonase (PG). Polygalacturonase sẽ phân cắt chuỗi pectin thành các đoạn ngắn hơn.
Trong sản xuất nƣớc quả từ nho, do nho là loại quả chứa nhiều dịch và đƣờng, trong thịt quả có chứa nhiều pectin vì vậy dễ gây đục hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thƣờng không có hiệu suất cao. Chính vì thế ngƣời ta phải xử lí nƣớc nho bằng chế phẩm enzyme. Lƣợng enzyme sử dụng trong trƣờng hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lƣợng nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đã làm nát, ngƣời ta cũng xử lý enzyme với liều lƣợng 0,2% so với khối lƣợng nho. Thời gian xử lí bằng enzyme là 3 giờ ở nhiệt độ 45 oC. Bằng phƣơng pháp xử lí này ngƣời ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3% đối với nho trắng và từ 66 lên 82,2% đối với nho đỏ (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004). Trong sản xuất nƣớc táo và nƣớc quả vải, sử dụng enzyme sẽ làm tăng hiệu suất tách dịch quả lên 20 ÷ 25%. Hoạt động chính của enzyme endo – polygalacturonase, pectimetylesterase và pectin lyase giúp quá trình ép là thủy phân các khung xƣơng chính của pectin, phá
vỡ thành tế bào làm các tế bào khó liên kết lại với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Khi xử lý nƣớc quả bằng enzyme đối với nƣớc táo, ngƣời ta thƣờng cho thêm ascorbic acid vào để chống quá trình oxy hoá. Trong sản xuất nƣớc táo, khi sử dụng chế phẩm pectinase đã mang lại hiệu quả cao.
Bên cạnh việc sử dụng enzyme để thuỷ phân pectin làm tăng hiệu suất thu hồi khi ép lấy dịch quả thì sự thuỷ phân một phần tế bào bởi enzyme cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cải thiện chất lƣợng cảm quan của dịch quả. Hoạt động thủy phân pectin bởi enzyme đã đƣợc ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt nƣớc trái c ây vì thế làm tăng nồng độ các thành phần chất chiết.
Khi sử dụng PME cần lƣu ý là hoạt động của PME cũng sẽ bị ức chế bởi nồng độ cao của đƣờng. Khi nƣớc ép cô đặc đến 60 oBrix enzyme sẽ không hoạt động nhƣng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nƣớc).
Lên men cà phê và ca cao cũng là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong quá trình lên men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trƣớc khi hạt đƣợc sấy khô (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004).
2.5.1.2 Làm trong dịch quả
Quá trình ép thông thƣờng thu dịch quả có độ nhớt và độ đục rất cao do có chứa một lƣợng lớn pectin gây hiện tƣợng độ nhớt cao và đục nƣớc. Việc loại bỏ các chất pectin có thể thực hiện bằng cách kết tủa hay thủy phân, sản phẩm tạo thành mất đi tính keo làm dễ dàng hơn quá trình lắng các hạt tử gây vẻ đục. Các hạt tử bấy giờ dễ tách ra bằng ly tâm, lọc hay lắng.
Trƣờng hợp kết tủa, enzyme pectimetylesterase đƣợc sử dụng kết hợp với việc bổ sung ion calci kéo theo sự tạo thành các gel Calcium pectate, tạo nên cái bẫy để kéo theo các phần tử gây đục. Các gel này co lại và lắng trong dịch quả, hay ngƣợc lại chúng nổi trên bề mặt khi lên men do tác dụng của CO2, đây là trƣờng hợp sản xuất nƣớc quả lên men độ rƣợu.
Trƣờng hợp thủy phân, làm trong bằng tác dụng kết hợp giữa enzyme PME và PG. PME sẽ phân cắt nhóm metyl của pectin tạo điều kiện cho PG phân cắt pectin thành những đoạn ngắn hơn, những phân tử nhỏ hơn và rời rạc tạo điều kiện để cặn lắng thu đƣợc nƣớc quả trong.
Ngoài ra, do các phần tử đục đƣợc tạo nên từ protein liên kết với các pectin thƣờng có mạch bên giàu arabinan và galactan. Ở pH của dịch quả các protein này tích điện dƣơng và bao quanh nó là các pectin tích điện âm. Phân huỷ pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dƣơng và pectin tích điện âm.
Do lớp vỏ ngoài tích điện cùng dấu nên chúng đẩy nhau và ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục. Khi xử lý với enzyme, lớp vỏ pectin sẽ bị phân cắt làm các protein lộ ra làm các hạt sẽ hút nhau bằng lực hút tĩnh điện. Chính vì vậy các phần tử này kết lắng với nhau và dịch quả đƣợc làm trong.
Sử dụng enzyme pectinase để làm trong đƣợc ứng dụng trong công nghiệp sản xuất rƣợu vang nho, rƣợu lên mên từ dịch trái cây nhƣ: táo, chuối, …Ngoài ra, pectinase còn có thể đƣợc dùng làm chất tạo đông khi sản xuất mứt quả cô đặc, mứt đông. (Ly Nguyen Binh, 2004; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.5.2 Cải thiện cấu trúc rau quả
PME cũng đƣợc khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của nhiều loại rau quả chế biến, nhƣ táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hoá một phần, sau đó pectin bị đề ester hoá này phản ứng với Ca2+, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn tạo đƣợc cấu trúc mong muốn (Van Puren, 1979).
2.5.3 Trích ly dƣợc liệu
Các dƣợc liệu có nguồn gốc thực vật, trong thành phần chúng ngoài các hoạt chất thì luôn luôn có pectin. Enzyme pectinase đƣợc sử dụng để phân giải các mô thực vật giúp các hoạt chất đƣợc giải phóng ra dễ dàng và triệt để hơn. Tuy nhiên, vì sử dụng cho mục đích sản xuất thuốc chữa bệnh nên khi dùng chế phẩm enzyme phải có độ tinh khiết rất cao để không mang theo những hoạt chất lạ vào thuốc, phải có hoạt độ cao để chỉ dùng với một lƣợng tối thiểu.
2.5.4 Trong chăn nuôi
Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngƣời ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn.
Hiện tƣợng đông tụ với calcium của pectin bị khử ester hoá bởi PME đƣợc khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc. Calcium hydroxide đƣợc thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đƣa pH về giá trị trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca2+ cao, làm kích hoạt PME, quá trình khử ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcium xảy ra. Chất lỏng đƣợc tiết ra và đƣợc ép, để chỉ có một phần nƣớc còn lại cần đƣợc loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nƣớc ép có thành phần tƣơng tự nhƣ nƣớc ép từ quả đƣợc cô thành mật và cũng đƣợc làm thức ăn cho gia súc. Lƣợng chế phẩm pectinase thƣờng dùng là 0,03 ÷ 0,05% so với nguyên liệu (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
Ly trích và tinh sạch PME từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã đƣợc thực hiện và đƣa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới. PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991; Solís-Pereira, 1993) , đặc biệt là A. niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với cả hai phƣơng thức lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006). Nghiên cứu của Joshi
Aspergillus niger trê
250
(NH4)2SO4
lên men rắn SSF sinh PME từ A.niger.
Tuy nhiên, các giá trị này thay đổi theo từng cơ chất, đặc điểm của chủng nấm mốc hay điều kiện nuôi cấy thực tế. Theo Trần Xuân Ngạch (2007), enzyme PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng từ 30 – 45 oC và bị vô hoạt ở 55
62 oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+
và Mg2+. Sarvamangala và cộng sự (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất là hạt của hoa hƣớng dƣơng và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trong quá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3% amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính của pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng lỏng (45,9U/g và 18,9U/g). Nhìn chung, quá trình lên men sinh enzyme PME cần phải đƣợc khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng và cơ chất, điều kiện môi trƣờng lên men.
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Địa điểm, thời gian 3.1.1 Địa điểm, thời gian
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ 02/02/2009 đến 03/05/2009
3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu
Nấm sợi Aspergillus niger (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Cần Thơ).
)
3.1.3 Thiết bị, hoá chất
3.1.3.1 Thiết bị
- Thiết bị thanh trùng
- Máy đo độ ẩm nhanh AD 50 MX
- Máy đo pH (TOA pH meter HM – 12P)
- Thiết bị chuẩn độ acid – bazơ tự động 785 – Titrino
- (CECIL, UK)
- Dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật
-
- Máy ép trái cây
- Một số dụng cụ và thiết bị khác 3.1.3.2 Hóa chất Cồn 90o NaOH 0,1N Muối NaCl Dung dịch đệm citrat
Amonium sulfate (NH4)2SO4
Diammonium hydro phosphate (NH4)2HPO4 Bromocresol green
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy 3.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Aspergillus niger đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt với thành phần
môi trƣờng là 70% cám, 25% trấu, 5% bột mì để sinh tổng hợp enzyme pectinmethylesterase. 3.2.2 3. iêu (cơ c ) - (Marcon et al., 2005) - - baz - (Vilarino et al., 1993) c (CFU/mL pH - - 2917:1999(E) 3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng việc sử dụng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA) để đƣa ra kết luận về sự sai biệt giữa các giá trị trung bình các nghiệm thức. Các số trung bình đƣợc so sánh bằng phƣơng pháp LSD.
3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc đến sự tổng hợp pectin methylesterase
3.3.1.1 Mục đích
Xác định độ ẩm và thời gian nuôi cấy thích hợp nấm mốc sinh pectin methylesterase có hoạt tính cao nhất.
3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố đƣợc khảo sát và ba lần lặp lại.
+ Nhân tố A: Độ ẩm môi trƣờng, thay đổi ở 4 mức độ
A1: 50% A2: 55% A3: 60% A4: 65%
+ Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy
B1: 42 giờ B2: 66 giờ B3: 90 giờ B4: 114 giờ
Số nghiệm thức là: 4 4 = 16
Số mẫu thí nghiệm: 16 3 = 48 mẫu
3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy có khối lƣợng là 10 g (70% cám + 25% trấu + 5% bột mì) cho mỗi mẫu thí nghiệm. Tiến hành điều chỉnh độ ẩm bằng nƣớc cất đến các mức độ ẩm khác nhau theo khảo sát. Môi trƣờng đƣợc xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến hành nuôi cấy Aspergillus niger (5 × 102 cfu/mL). Ứng với các mức thời gian ủ khác nhau, lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát độ ẩm và thời gian nuôi cấy nấm mốc
A1 A2 A3 A4
B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121 o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
3.3.1.4 Kết quả thu nhận
, từ đó xác định đƣợc độ ẩm môi trƣờng thích hợp và thời gian lên men
.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc đến khả năng sinh tổng hợp pectinmethylesterase
3.3.2.1 Mục đích
Xác định điều kiện pH môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase đạt hiệu quả cao.
3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố C: pH môi trƣờng C0: Đối chứng (pH = 5,8) C1: pH = 4 C2: pH = 4,5 C3: pH = 5 C4: pH = 5,5 C5: pH = 6 C6: pH = 6,5 Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm: 7 3 = 21 mẫu
3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mỗi mẫu thí nghiệm có khối lƣợng là 10 g. Sử dụng các thông số tối ƣu ở thí nghiệm 1 (thời gian và độ ẩm) để tiến hành thực hiện điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy. Sử dụng dung dịch đệm citrat ở các mức pH khác nhau để điều chỉnh pH môi trƣờng lên men. Nguyên liệu đƣợc xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến hành nuôi Aspergillus niger (5 × 102 cfu/mL) với các khoảng pH môi trƣờng khác nhau theo cùng một độ ẩm và khoảng thời gian tối ƣu. Sau đó lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
3.3.2.4 Kết quả thu nhận
Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME (U/mL) tƣơng ứng với điều kiện pH môi trƣờng khác nhau.
Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc
3.3.3 Thí nghiệm 3: Tác động của thành phần đạm bổ sung đến khả năng sinh pectinmethylesterase từ Aspergillus niger sinh pectinmethylesterase từ Aspergillus niger
3.3.3.1 Mục đích
Tìm ra loại đạm bổ sung thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME từ nấm mốc
A.niger đạt hiệu quả cao nhất. 3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố D: Thành phần đạm bổ sung
D0: Đối chứng (không bổ sung đạm)
D1: (NH4)2SO4 0,1%
D2: (NH4)2HPO4 0,1% Số nghiệm thức: 3
Số mẫu thí nghiệm: 33 = 9 mẫu
C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Độ ẩm tối ƣu theo kết quả thí nghiệm 1
Thời gian ủ thích hợp theo kết quả thí nghiệm 1
Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khoáng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc
3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mỗi mẫu thí nghiệm có khối lƣợng là 10 g. Sử dụng các thông số tối ƣu ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (pH, độ ẩm môi trƣờng thích hợp) để tiến hành bổ sung đạm vào môi trƣờng nuôi cấy. Làm mát môi trƣờng sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2mL huyền phù bào tử nấm mốc vào mỗi bình cấy (5 × 102
cfu/mL) và ủ ở nhiệt độ phòng theo thời gian ủ đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm 1. Sau đó lọc môi