PME cũng đƣợc khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của nhiều loại rau quả chế biến, nhƣ táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hoá một phần, sau đó pectin bị đề ester hoá này phản ứng với Ca2+, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn tạo đƣợc cấu trúc mong muốn (Van Puren, 1979).
2.5.3 Trích ly dƣợc liệu
Các dƣợc liệu có nguồn gốc thực vật, trong thành phần chúng ngoài các hoạt chất thì luôn luôn có pectin. Enzyme pectinase đƣợc sử dụng để phân giải các mô thực vật giúp các hoạt chất đƣợc giải phóng ra dễ dàng và triệt để hơn. Tuy nhiên, vì sử dụng cho mục đích sản xuất thuốc chữa bệnh nên khi dùng chế phẩm enzyme phải có độ tinh khiết rất cao để không mang theo những hoạt chất lạ vào thuốc, phải có hoạt độ cao để chỉ dùng với một lƣợng tối thiểu.
2.5.4 Trong chăn nuôi
Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngƣời ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn.
Hiện tƣợng đông tụ với calcium của pectin bị khử ester hoá bởi PME đƣợc khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc. Calcium hydroxide đƣợc thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đƣa pH về giá trị trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca2+ cao, làm kích hoạt PME, quá trình khử ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcium xảy ra. Chất lỏng đƣợc tiết ra và đƣợc ép, để chỉ có một phần nƣớc còn lại cần đƣợc loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nƣớc ép có thành phần tƣơng tự nhƣ nƣớc ép từ quả đƣợc cô thành mật và cũng đƣợc làm thức ăn cho gia súc. Lƣợng chế phẩm pectinase thƣờng dùng là 0,03 ÷ 0,05% so với nguyên liệu (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
Ly trích và tinh sạch PME từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã đƣợc thực hiện và đƣa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới. PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991; Solís-Pereira, 1993) , đặc biệt là A. niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với cả hai phƣơng thức lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006). Nghiên cứu của Joshi
Aspergillus niger trê
250
(NH4)2SO4
lên men rắn SSF sinh PME từ A.niger.
Tuy nhiên, các giá trị này thay đổi theo từng cơ chất, đặc điểm của chủng nấm mốc hay điều kiện nuôi cấy thực tế. Theo Trần Xuân Ngạch (2007), enzyme PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng từ 30 – 45 oC và bị vô hoạt ở 55
62 oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+
và Mg2+. Sarvamangala và cộng sự (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất là hạt của hoa hƣớng dƣơng và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trong quá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3% amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính của pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng lỏng (45,9U/g và 18,9U/g). Nhìn chung, quá trình lên men sinh enzyme PME cần phải đƣợc khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng và cơ chất, điều kiện môi trƣờng lên men.
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Địa điểm, thời gian 3.1.1 Địa điểm, thời gian
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ 02/02/2009 đến 03/05/2009
3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu
Nấm sợi Aspergillus niger (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Cần Thơ).
)
3.1.3 Thiết bị, hoá chất
3.1.3.1 Thiết bị
- Thiết bị thanh trùng
- Máy đo độ ẩm nhanh AD 50 MX
- Máy đo pH (TOA pH meter HM – 12P)
- Thiết bị chuẩn độ acid – bazơ tự động 785 – Titrino
- (CECIL, UK)
- Dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật
-
- Máy ép trái cây
- Một số dụng cụ và thiết bị khác 3.1.3.2 Hóa chất Cồn 90o NaOH 0,1N Muối NaCl Dung dịch đệm citrat
Amonium sulfate (NH4)2SO4
Diammonium hydro phosphate (NH4)2HPO4 Bromocresol green
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy 3.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Aspergillus niger đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt với thành phần
môi trƣờng là 70% cám, 25% trấu, 5% bột mì để sinh tổng hợp enzyme pectinmethylesterase. 3.2.2 3. iêu (cơ c ) - (Marcon et al., 2005) - - baz - (Vilarino et al., 1993) c (CFU/mL pH - - 2917:1999(E) 3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng việc sử dụng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA) để đƣa ra kết luận về sự sai biệt giữa các giá trị trung bình các nghiệm thức. Các số trung bình đƣợc so sánh bằng phƣơng pháp LSD.
3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men và độ ẩm môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc đến sự tổng hợp pectin methylesterase
3.3.1.1 Mục đích
Xác định độ ẩm và thời gian nuôi cấy thích hợp nấm mốc sinh pectin methylesterase có hoạt tính cao nhất.
3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố đƣợc khảo sát và ba lần lặp lại.
+ Nhân tố A: Độ ẩm môi trƣờng, thay đổi ở 4 mức độ
A1: 50% A2: 55% A3: 60% A4: 65%
+ Nhân tố B: Thời gian nuôi cấy
B1: 42 giờ B2: 66 giờ B3: 90 giờ B4: 114 giờ
Số nghiệm thức là: 4 4 = 16
Số mẫu thí nghiệm: 16 3 = 48 mẫu
3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy có khối lƣợng là 10 g (70% cám + 25% trấu + 5% bột mì) cho mỗi mẫu thí nghiệm. Tiến hành điều chỉnh độ ẩm bằng nƣớc cất đến các mức độ ẩm khác nhau theo khảo sát. Môi trƣờng đƣợc xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến hành nuôi cấy Aspergillus niger (5 × 102 cfu/mL). Ứng với các mức thời gian ủ khác nhau, lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát độ ẩm và thời gian nuôi cấy nấm mốc
A1 A2 A3 A4
B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121 o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
3.3.1.4 Kết quả thu nhận
, từ đó xác định đƣợc độ ẩm môi trƣờng thích hợp và thời gian lên men
.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc đến khả năng sinh tổng hợp pectinmethylesterase
3.3.2.1 Mục đích
Xác định điều kiện pH môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp pectinmethylesterase đạt hiệu quả cao.
3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố C: pH môi trƣờng C0: Đối chứng (pH = 5,8) C1: pH = 4 C2: pH = 4,5 C3: pH = 5 C4: pH = 5,5 C5: pH = 6 C6: pH = 6,5 Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm: 7 3 = 21 mẫu
3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mỗi mẫu thí nghiệm có khối lƣợng là 10 g. Sử dụng các thông số tối ƣu ở thí nghiệm 1 (thời gian và độ ẩm) để tiến hành thực hiện điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy. Sử dụng dung dịch đệm citrat ở các mức pH khác nhau để điều chỉnh pH môi trƣờng lên men. Nguyên liệu đƣợc xử lí, hấp thanh trùng sau đó tiến hành nuôi Aspergillus niger (5 × 102 cfu/mL) với các khoảng pH môi trƣờng khác nhau theo cùng một độ ẩm và khoảng thời gian tối ƣu. Sau đó lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
3.3.2.4 Kết quả thu nhận
Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME (U/mL) tƣơng ứng với điều kiện pH môi trƣờng khác nhau.
Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc
3.3.3 Thí nghiệm 3: Tác động của thành phần đạm bổ sung đến khả năng sinh pectinmethylesterase từ Aspergillus niger sinh pectinmethylesterase từ Aspergillus niger
3.3.3.1 Mục đích
Tìm ra loại đạm bổ sung thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME từ nấm mốc
A.niger đạt hiệu quả cao nhất. 3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố D: Thành phần đạm bổ sung
D0: Đối chứng (không bổ sung đạm)
D1: (NH4)2SO4 0,1%
D2: (NH4)2HPO4 0,1% Số nghiệm thức: 3
Số mẫu thí nghiệm: 33 = 9 mẫu
C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Độ ẩm tối ƣu theo kết quả
thí nghiệm 1
Thời gian ủ thích hợp theo kết quả thí nghiệm 1
Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khoáng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc
3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị mỗi mẫu thí nghiệm có khối lƣợng là 10 g. Sử dụng các thông số tối ƣu ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (pH, độ ẩm môi trƣờng thích hợp) để tiến hành bổ sung đạm vào môi trƣờng nuôi cấy. Làm mát môi trƣờng sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2mL huyền phù bào tử nấm mốc vào mỗi bình cấy (5 × 102
cfu/mL) và ủ ở nhiệt độ phòng theo thời gian ủ đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm 1. Sau đó lọc môi trƣờng với nƣớc cất và thu nhận enzyme.
.
3.3.3.4 Kết quả thu nhận
Hoạt tính PME (U/mL) tƣơng ứng với từng nghiệm thức thí nghiệm.
Xác định các điều kiện cơ bản cho quá trình lên men sinh PME từ A.niger trên môi trƣờng cơ bản (cơ chất cảm ứng bột mì).
D0 D1 D2 Nguyên liệu môi trƣờng
Hấp thanh trùng (121o
C, 15 phút)
Làm nguội
Nuôi cấy vi sinh vật
Thu nhận enzyme
Aspergillus niger
Độ ẩm tối ƣu theo kết quả TN 1 pH môi trƣờng thích hợp theo TN 2
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Quá trình trích ly PME từ nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều các thông số nhƣ điều kiện nuôi cấy, lên men; tỷ lệ pha loãng của cơ chất, điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian ủ cũng nhƣ tác động của các thành phần khoáng và phụ gia nhƣ Nitrogen, các muối MgSO4, MnSO4, NaCl và FeCl3 …(Berovic et al., 1993; Schmitz, 2002; Hamdy, 2005; Joshi et al., 2006). Hiệu quả trích ly cũng nhƣ hoạt tính của PME sẽ đƣợc cải thiện khi các thông số trên đƣợc thực hiện ở giá trị tối ƣu. Chính vì thế, quá trình lên men sinh enzyme PME cần phải đƣợc khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng và cơ chất, điều kiện môi trƣờng lên men.
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG VÀ THỜI GIAN NUÔI CẤY A.NIGER ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTINMETHYLESTERASE CẤY A.NIGER ĐẾN SỰ TẠO THÀNH PECTINMETHYLESTERASE
Tiến hành nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger ở các môi trƣờng có độ ẩm khác
nhau, tƣơng ứng với từng khoảng thời gian ủ, trích ly và đo hoạt tính PME (U/mL). Kết quả đƣợc tổng hợp và thể hiện ở bảng 4.
Bảng 4: Hoạt tính PME (U/mL) thu đƣợc theo độ ẩm môi trƣờng và thời gian nuôi cấy
Thời gian (giờ) Độ ẩm (%) Hoạt tính PME trung bình (U/mL)
42 50 15,758 ± 2,799 55 31,256 ± 5,875 60 32,598 ± 6,379 65 34,213 ± 5,727 66 50 12,574 ± 3,241 55 60,130 ± 5,067 60 44,113 ± 6,856 65 32,598 ± 5,657 90 50 21,111 ± 3,615 55 62,797 ± 5,819 60 47,031 ± 3,789 65 39,549 ± 5,728 114 50 36,075 ± 5,864 55 39,816 ± 5,167 60 35,273 ± 5,094 65 31,532 ± 2,816
Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại Giá trị trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại
Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng (Lê Xuân Phương, 2004), vì vậy nếu độ ẩm môi trƣờng không thích hợp thì vi sinh vật
sẽ khó tiếp nhận thức ăn, nên không phát triển đƣợc làm kìm hãm sự tổng hợp enzyme. Ngoài ra, hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào sự phát triển của tế bào nấm mốc. Thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzyme thu cao hay thấp.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
42 66 90 114
Thời gian ủ (giờ)
Ho ạt tí nh PM E ( U/m L) Độ ẩm MT 50% Độ ẩm MT 55% Độ ẩm MT 60% Độ ẩm MT 65%
Hình 10: Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng lên men và thời gian ủ đến hiệu quả sinh PME từ A.niger
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4 và hình 10 cho thấy khả năng sinh PME từ A.niger trên môi trƣờng trấu, cám và bột mì chịu sự chi phối cả ở độ ẩm
môi trƣờng và thời gian ủ.
Với độ ẩm môi trƣờng lên men thấp (50%), nƣớc cung cấp không đủ cho các phản ứng sinh lý, sinh hóa bên trong nấm mốc, gây cản trở sự sinh trƣởng và phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004), chính vì thế hoạt tính PME thu đƣợc tƣơng ứng với mức độ ẩm này thấp hơn hẳn khi so sánh với PME thu đƣợc từ môi trƣờng nuôi cấy có độ ẩm cao hơn (55, 60 và 65%), trừ trƣờng hợp PME đƣợc trích ly sau 5 ngày hay 114 giờ ủ. Ở mức độ ẩm thấp, nấm mốc cần thời gian dài hơn để có thể thích nghi với điều kiện môi trƣờng, gia tăng mật số và sinh tổng hợp PME (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004; Joshi, 2006). Chính vì thế, hoạt tính PME khi lên men ở độ ẩm môi trƣờng 50% tăng dần theo thời gian lên men và đạt giá trị cao nhất sau 5 ngày lên men (36,075 ± 5,864 U/mL) ở cùng điều kiện. Tuy nhiên, giá trị hoạt tính này vẫn khá thấp hơn so với PME thu đƣợc ở các chế độ khảo sát độ ẩm môi trƣờng từ 55 đến 65%.
Nhìn chung, thời gian ủ tối ƣu để sinh PME từ A.niger là 90 giờ khi độ ẩm môi
trƣờng lên men thay đổi từ 55 đến 65%. Ngay sau khi nuôi cấy 42 giờ, nấm mốc chƣa gia tăng mật số, đây là thời gian chúng làm quen với môi trƣờng sống và chuẩn bị cho sự tăng trƣởng vƣợt bậc, nên thời điểm này là quá sớm để thu nhận
enzyme. Bắt đầu từ sau 42 giờ, nấm mốc đã thích nghi với môi trƣờng, dinh dƣỡng vẫn còn đảm bảo cho quá trình phát triển, do vậy mật số đƣợc nhân lên với tốc độ rất nhanh, quá trình này diễn ra đồng thời với lƣợng enzym đƣợc tổng hợp ngày càng nhiều. Từ sau 60 giờ nuôi cấy, sự phát triển của nấm mốc bắt đầu chậm lại, lƣợng enzyme tổng hợp đƣợc cũng giảm do lƣợng dinh dƣỡng trong môi trƣờng đã bị nấm mốc sử dụng trong các quá trình phát triển sinh khối. Đến 90 giờ, lƣợng enzyme thu đƣợc là nhiều nhất. Tuy nhiên, đây cũng là thời gian nấm mốc bắt đầu sinh bào tử. Do môi trƣờng đã không đủ dinh dƣỡng, mật số nấm mốc cao là điều kiện bất lợi cho nấm mốc phát triển và tổng hợp PME. Theo nghiên cứu của Aguilar và Huitron (1990); Galiotou-Panayotou và Kapantai, (1993); Solis-Pereyra
et al., (1993); Taragano et al., (1997) cũng cho thấy, thời gian ủ tối ƣu cho quá
trình lên men rắn A.niger sinh PME thay đổi trong khoảng 90 đến 120 giờ. Vì vậy, ở 90 giờ là thời điểm tốt nhất để thu chế phẩm enzyme. Nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy thì hoạt tính enzyme thu đƣợc sẽ giảm đáng kể.
Hoạt tính PME sau 90 giờ ủ ở độ ẩm môi trƣờng 55% cho giá trị cao nhất (62,797 ± 5,819 U/mL) khi so sánh với giá trị thu đƣợc ở độ ẩm cao hơn 60 và 65% (hoạt tính PME lần lƣợt là 47,031 ± 3,789 U/mL và 39,549 ± 5,728 U/mL). Môi trƣờng lên men có độ ẩm 55% có mức độ thoáng khí cao nên sự trao đổi ẩm và nhiệt độ trong
