2.4.5.1 Quy trình kỹ thuật sản xuất enzyme pectinmethylesterase
Thời gian (giờ) Sinh khối Enzyme Nhiệt độ Chất dinh dƣỡng
Hình 6: Sơ đồ quá trình sản xuất enzyme bằng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002) 2.4.5.2 Thuyết minh quy trình
* Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy bề mặt của vi sinh vật tạo enzyme pectinmethylesterase gồm có 60 ÷ 70% là bột cám, 20 ÷ 25% trấu, nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng tổng hợp enzyme pectinase tƣơng ứng là 5 ÷ 10% bột mì và bổ sung amonium sulfate và amonium chloride 1%, amonium phosphate 2%. Độ ẩm môi trƣờng là 60 ÷ 65% . Đem môi trƣờng thanh trùng ở 121 o
C trong vòng 15 phút. Sau khi thanh trùng, môi trƣờng đƣợc làm nguội xuống nhiệt độ phòng và bắt đầu cấy giống vi sinh vật là Aspergillus niger vào môi trƣờng đã đƣợc trộn đều, trải mỏng trên khay.
* Nuôi cấy vi sinh vật
Tiến hành nuôi nấm sợi trong tủ ấm ổn định ở nhiệt độ khoảng 37 o
C. Trong khoảng 36 giờ thì kết thúc quá trình nuôi. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme đƣợc tạo ra nhiều nhất. Đây là giai đoạn thích hợp cho việc thu nhận chế phẩm enzyme thô (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2003).
Chế phẩm enzyme thô Môi trƣờng
Hấp thanh trùng
Làm nguội
Sấy kết tủa
Chế phẩm enzyme tinh khiết Ly tâm
Lọc Trích ly Nuôi cấy vi sinh vật
Nghiền và bảo quản
* Trích ly enzyme
Chiết tách enzyme từ môi trƣờng rắn ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính,… có thể chiết tách đƣợc 90 ÷ 95% và trong nƣớc chiết không chứa tạp chất không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít formalin hoặc chất sát trùng khác. Chiết tách enzyme ngƣời ta dùng nƣớc (25 ÷ 28 oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nƣớc bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trƣờng, đẩy một lƣợng lớn nƣớc. Vì vậy các enzyme, cũng nhƣ các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nƣớc dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn - nƣớc phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein.
Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3 ÷ 5 oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60 ÷ 70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5 ÷ 5,6 bằng (NH4)2SO4 600g/L.
Khi kết tủa bằng ethanol, chế phẩm enzyme thu đƣợc có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu dùng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Khi kết tủa bằng ammonium sulfat có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu đƣợc chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hòa là 0,9 ÷ 1 thì sẽ thu đƣợc chế phẩm chỉ chứa pectin transeliminase và exo - polygalacturonase.
* Ly tâm
Trong công nghệ enzyme, phƣơng pháp ly tâm thƣờng đƣợc ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan.
Khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nƣớc, protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tƣợng biến tính của enzyme, thƣờng tiến hành ly tâm lạnh (3 ÷ 5 o
C). (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002; Schmitz, 2002). * Sấy kết tủa
Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nƣớc. Để dễ bảo quản, tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp hơn 40 o
C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 ÷ 8%.
* Nghiền và bảo quản
Sau khi sấy, enzyme đƣợc nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín (chai lọ hoặc túi polyetylen), bảo quản ở nhiêt độ lạnh.
Chế phẩm enzyme này gọi là chế phẩm dạng rắn thô. M uốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tinh chế.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.4.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp pectin methylesterase
Sự tổng hợp PME phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau trong suốt quá trình nuôi cấy cũng nhƣ tổng hợp enzyme. Việc đo lƣờng hoạt tính đã chỉ ra sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các điều kiện nuôi cấy khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau của PME (Bordenave và Goldberg, 1993).
2.4.6.1 Môi trường nuôi cấy
Trên từng loại nguyên liệu khác nhau, khả năng sinh PME cũng khác nhau, ngay cả các mô khác nhau trên cùng một loại nguyên liệu cũng có ảnh hƣởng lớn đến quá trình tổng hợp của Aspergillus niger.
2.4.6.2 Độ ẩm
Độ ẩm cao sẽ làm môi trƣờng dễ kết dính, ảnh hƣởng đến độ thoáng khí. Ngƣợc lại, độ ẩm môi trƣờng thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi cũng nhƣ khả năng tạo enzyme.
2.4.6.3 Nhiệt độ
Nấm mốc Aspergillus niger phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 30 oC. Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme.
2.4.6.4 pH
Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt thƣờng ít ảnh hƣởng do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme.
2.4.6.5 Thời gian ủ
Thời gian nuôi để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tƣợng không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử
2.5 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PECTINMETHYLESTERASE 2.5.1 Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang 2.5.1 Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang
Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nƣớc trái cây và rƣợu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất này nằm ở thành tế bào đƣợc phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nƣớc quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật.
Việc thu nhận nƣớc quả từ trƣớc đến nay chủ yếu bằng phƣơng pháp ép. Nếu pectin còn nhiều sẽ theo vào nƣớc quả gây ra hiện tƣợng nƣớc quả bị đục, có độ keo cao và rất khó lọc trong.
2.5.1.1 Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả
Trong tế bào của quả nƣớc chiếm khoảng 90 ÷ 95%. Nếu chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận đƣợc khoảng 60 ÷ 70% là tối đa. Bởi vì khi nghiền ép, trong phần nƣớc quả thu đƣợc sẽ kéo theo lƣợng lớn thịt quả, chủ yếu là pectin. Pectin là thành phần quan trọng của vách tế bào có nhiệm vụ bảo vệ các thành phần bên trong tế bào, giữ dịch bào trong tế bào không thoát ra.
Việc bổ sung enzyme pectinesterase sẽ giúp tăng hiệu suất ép 15 ÷ 30%, thậm chí đến 50%, nhờ vào tác động thủy phân của PME lên pectin của vách tế bào làm dịch bào thoát ra. Lúc đầu PME sẽ phân cắt nhóm methyl của pectin tạo điều kiện cho hoạt động của enzyme polygalacturonase (PG). Polygalacturonase sẽ phân cắt chuỗi pectin thành các đoạn ngắn hơn.
Trong sản xuất nƣớc quả từ nho, do nho là loại quả chứa nhiều dịch và đƣờng, trong thịt quả có chứa nhiều pectin vì vậy dễ gây đục hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thƣờng không có hiệu suất cao. Chính vì thế ngƣời ta phải xử lí nƣớc nho bằng chế phẩm enzyme. Lƣợng enzyme sử dụng trong trƣờng hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lƣợng nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đã làm nát, ngƣời ta cũng xử lý enzyme với liều lƣợng 0,2% so với khối lƣợng nho. Thời gian xử lí bằng enzyme là 3 giờ ở nhiệt độ 45 oC. Bằng phƣơng pháp xử lí này ngƣời ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3% đối với nho trắng và từ 66 lên 82,2% đối với nho đỏ (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004). Trong sản xuất nƣớc táo và nƣớc quả vải, sử dụng enzyme sẽ làm tăng hiệu suất tách dịch quả lên 20 ÷ 25%. Hoạt động chính của enzyme endo – polygalacturonase, pectimetylesterase và pectin lyase giúp quá trình ép là thủy phân các khung xƣơng chính của pectin, phá
vỡ thành tế bào làm các tế bào khó liên kết lại với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Khi xử lý nƣớc quả bằng enzyme đối với nƣớc táo, ngƣời ta thƣờng cho thêm ascorbic acid vào để chống quá trình oxy hoá. Trong sản xuất nƣớc táo, khi sử dụng chế phẩm pectinase đã mang lại hiệu quả cao.
Bên cạnh việc sử dụng enzyme để thuỷ phân pectin làm tăng hiệu suất thu hồi khi ép lấy dịch quả thì sự thuỷ phân một phần tế bào bởi enzyme cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cải thiện chất lƣợng cảm quan của dịch quả. Hoạt động thủy phân pectin bởi enzyme đã đƣợc ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt nƣớc trái c ây vì thế làm tăng nồng độ các thành phần chất chiết.
Khi sử dụng PME cần lƣu ý là hoạt động của PME cũng sẽ bị ức chế bởi nồng độ cao của đƣờng. Khi nƣớc ép cô đặc đến 60 oBrix enzyme sẽ không hoạt động nhƣng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nƣớc).
Lên men cà phê và ca cao cũng là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong quá trình lên men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trƣớc khi hạt đƣợc sấy khô (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2004).
2.5.1.2 Làm trong dịch quả
Quá trình ép thông thƣờng thu dịch quả có độ nhớt và độ đục rất cao do có chứa một lƣợng lớn pectin gây hiện tƣợng độ nhớt cao và đục nƣớc. Việc loại bỏ các chất pectin có thể thực hiện bằng cách kết tủa hay thủy phân, sản phẩm tạo thành mất đi tính keo làm dễ dàng hơn quá trình lắng các hạt tử gây vẻ đục. Các hạt tử bấy giờ dễ tách ra bằng ly tâm, lọc hay lắng.
Trƣờng hợp kết tủa, enzyme pectimetylesterase đƣợc sử dụng kết hợp với việc bổ sung ion calci kéo theo sự tạo thành các gel Calcium pectate, tạo nên cái bẫy để kéo theo các phần tử gây đục. Các gel này co lại và lắng trong dịch quả, hay ngƣợc lại chúng nổi trên bề mặt khi lên men do tác dụng của CO2, đây là trƣờng hợp sản xuất nƣớc quả lên men độ rƣợu.
Trƣờng hợp thủy phân, làm trong bằng tác dụng kết hợp giữa enzyme PME và PG. PME sẽ phân cắt nhóm metyl của pectin tạo điều kiện cho PG phân cắt pectin thành những đoạn ngắn hơn, những phân tử nhỏ hơn và rời rạc tạo điều kiện để cặn lắng thu đƣợc nƣớc quả trong.
Ngoài ra, do các phần tử đục đƣợc tạo nên từ protein liên kết với các pectin thƣờng có mạch bên giàu arabinan và galactan. Ở pH của dịch quả các protein này tích điện dƣơng và bao quanh nó là các pectin tích điện âm. Phân huỷ pectin sẽ giải phóng ra một phần protein tích điện dƣơng và pectin tích điện âm.
Do lớp vỏ ngoài tích điện cùng dấu nên chúng đẩy nhau và ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục. Khi xử lý với enzyme, lớp vỏ pectin sẽ bị phân cắt làm các protein lộ ra làm các hạt sẽ hút nhau bằng lực hút tĩnh điện. Chính vì vậy các phần tử này kết lắng với nhau và dịch quả đƣợc làm trong.
Sử dụng enzyme pectinase để làm trong đƣợc ứng dụng trong công nghiệp sản xuất
rƣợu vang nho, rƣợu lên mên từ dịch trái cây nhƣ: táo, chuối, …Ngoài ra, pectinase
còn có thể đƣợc dùng làm chất tạo đông khi sản xuất mứt quả cô đặc, mứt đông.
(Ly Nguyen Binh, 2004; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.5.2 Cải thiện cấu trúc rau quả
PME cũng đƣợc khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của nhiều loại rau quả chế biến, nhƣ táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hoá một phần, sau đó pectin bị đề ester hoá này phản ứng với Ca2+, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn tạo đƣợc cấu trúc mong muốn (Van Puren, 1979).
2.5.3 Trích ly dƣợc liệu
Các dƣợc liệu có nguồn gốc thực vật, trong thành phần chúng ngoài các hoạt chất thì luôn luôn có pectin. Enzyme pectinase đƣợc sử dụng để phân giải các mô thực vật giúp các hoạt chất đƣợc giải phóng ra dễ dàng và triệt để hơn. Tuy nhiên, vì sử dụng cho mục đích sản xuất thuốc chữa bệnh nên khi dùng chế phẩm enzyme phải có độ tinh khiết rất cao để không mang theo những hoạt chất lạ vào thuốc, phải có hoạt độ cao để chỉ dùng với một lƣợng tối thiểu.
2.5.4 Trong chăn nuôi
Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngƣời ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn.
Hiện tƣợng đông tụ với calcium của pectin bị khử ester hoá bởi PME đƣợc khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc. Calcium hydroxide đƣợc thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đƣa pH về giá trị trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca2+ cao, làm kích hoạt PME, quá trình khử ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcium xảy ra. Chất lỏng đƣợc tiết ra và đƣợc ép, để chỉ có một phần nƣớc còn lại cần đƣợc loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nƣớc ép có thành phần tƣơng tự nhƣ nƣớc ép từ quả đƣợc cô thành mật và cũng đƣợc làm thức ăn cho gia súc. Lƣợng chế phẩm pectinase thƣờng dùng là 0,03 ÷ 0,05% so với nguyên liệu (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
Ly trích và tinh sạch PME từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã đƣợc thực hiện và đƣa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới. PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991; Solís-Pereira, 1993) , đặc biệt là A. niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với cả hai phƣơng thức lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006). Nghiên cứu của Joshi
Aspergillus niger trê
250
(NH4)2SO4
lên men rắn SSF sinh PME từ A.niger.
Tuy nhiên, các giá trị này thay đổi theo từng cơ chất, đặc điểm của chủng nấm mốc hay điều kiện nuôi cấy thực tế. Theo Trần Xuân Ngạch (2007), enzyme PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng từ 30 – 45 oC và bị vô hoạt ở 55
62 oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+
và Mg2+. Sarvamangala và cộng sự (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất là hạt của hoa hƣớng dƣơng và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trong quá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3% amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính của pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng lỏng (45,9U/g và 18,9U/g). Nhìn chung, quá trình lên men sinh enzyme PME cần phải đƣợc khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng và cơ chất, điều kiện môi trƣờng lên men.
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Địa điểm, thời gian
