3.2.2.1. Kết quả nghiên cứu
- Kết quả thí nghiệm tác dụng chống viêm cấp được mô tả ở Bảng 3.5 và
41
Bảng 3.5: So sánh tác dụng chống viêm cấp của mẫu thử phân đoạn EtOAc so với lô chứng bệnh lý
Lô thí nghiệm
Sau 3 giờ gây phù Sau 5 giờ gây phù Sau 24 giờ gây phù
Độ phù (%) % giảm so với chứng Độ phù (%) % giảm so với chứng Độ phù (%) % giảm so với chứng Chứng bệnh lý 47,9±5,2 46,9±5,4 23,1±3,9 EtOAc ĐG ( 2,4 g dl/ kg) 52,7±4,1 (0) -10,02 45,9±3,7 (0) 2,13 22,1±2,4 (0) 4,33 EtOAc ĐG ( 4,8 g dl/ kg) 48,1±3,7 (0) -0,42 43,2±3,5 (0) 7,89 20,2±3,7 (0) 12,56 Diclofenac 10 mg/kg 11,1±0,7* 76,83 19,3±4,2* 58,84 10,8±2,1* 53,25
Chú thích: *: p < 0,05. Kết quả so với lô chứng ở cùng thời điểm. (0): p > 0,05
Kết quả Bảng 3.5 cho thấy: Lô uống mẫu cao phân đoạn EtOAC có mức độ phù bàn chân chuột thấp hơn so với lô chứng bệnh lý, tuy nhiên sự khác nhau là không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Khi tăng liều, mức độ phù bàn chân có xu hướng giảm. Mẫu đối chứng dương diclofenac liều 10 mg/kg đã có tác dụng ức chế độ phù gây bởi carragenin so với lô chứng bệnh lý rõ rệt, đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
42 0 10 20 30 40 50 60 70 1 6 11 16 21 26
THỜI GIAN (GIỜ)
M Ứ C Đ Ộ P HÙ B ÀN CHÂN CHUỘT ( %) Lô chứng EtOAc ĐG 2,4 gdl/kg EtOAc ĐG 4,8 gdl/kg Diclofenac 10mg/kg
Hình 3.8: Mức độ phù bàn chân chuột (%) theo thời gian (giờ) của các lô chuột thí nghiệm
3.2.2.2. Kết luận
- Tác dụng chống viêm cấp của cao EtOAc ở 2 mức liều 2,4 và 4,8 gdl/kg là kém, không đáng kể. Do vậy có thể kết luận cao phân đoạn EtOAc chưa thể hiện tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bởi carragenin ở 2 mức liều trên.
43
Chƣơng 4: BÀN LUẬN 4.1. Về hóa học
- Về định tính:
Trong quá trình làm thực nghiệm với mẫu thu hái vào tháng 11/2016 tại Thái Nguyên trong cây Dây đòn gánh có chứa các nhóm chất flavonoid, saponin triterpenoid, đường khử, caroten và sterol.
Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trước đây của các tác giả Nguyễn Văn An [1], Nguyễn Thị Thủy [14], Đặng Thị Thủy [15].
- Về phân lập hợp chất:
Việc lựa chọn cắn cao phân đoạn EtOAc để tiếp nối chuỗi đề tài nghiên cứu tổng thể về cây Dây đòn gánh được dựa trên kết quả khảo sát tác dụng chống oxy và phân lập của Đặng Thị Thủy năm 2016, trong đó phân đoạn EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong 4 phân đoạn thử nghiệm, 2 hợp chất cũng tách được từ phân đoạn này [15].
Bằng phương pháp sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ là silica gel và sephadex LH20 2 hợp chất Catechin và Quercitrin đã được nhận dạng. Đây đều là 2 hợp chất có mặt trong nhiều cây, tuy nhiên lần đầu được tìm thấy ở cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.)..
+ Quercitrin là một glyscosid phổ biến của quercetin, xuất hiện ở trong loài thực vật. Quercitrin cho thấy tác dụng chống oxy hóa, chống viêm [21], kháng tế bào ung thư [20] ... đặc biệt quercitrin cho thấy tác dụng bảo vệ dạ dày, chống loét dạ dày mạnh [22], [35].
Mejbua JLN và cộng sự đã nghiên cứu thấy tác dụng chống viêm mạnh của quercitrin. Tác dụng này thể hiện ở việc quercitrin ức chế sản xuất prostaglandin D2 thông qua COX–2 với IC50= 7,3 µM và sự sản xuất leukotriene C4 thông qua 5–lipoxygenase với IC50= 5,1 µM [35].
Theo nhóm nghiên cứu Caimuesco, quercitrin có tác dụng chống viêm một trên chuột thực nghiệm bị gây viêm bằng cách cho uống nước chứa
44
dextran sodium sulfate (DSS). Sau khi dùng đường uống, quercitrin giúp phòng ngừa viêm ruột ở liều 1 và 5 mg/kg đối với chuột khỏe mạnh. Đối với chuột đã bị viêm, quercitrin với liều 1 mg/kg/ngày giúp đẩy nhanh quá trình phục hồi [21].
Taguchi và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống viêm quercitrin trên nhiều mô hình khác nhau thử nghiệm trên chuột lang, chuột cống và chuột nhắt. Kết quả cho thấy quercitrin khi dùng đường uống với các mức liều 50, 100 và 200 mg/kg có tác dụng giảm phù ở chân chuột gây ra do các tác nhân khác nhau như carrageenin, dextran, histamine, serotonin và bradykinin. Ở liều 200 mg/ kg, chất này còn ức chế phù do nước nóng (540
C). Tuy nhiên, quercitrin lại không thể hiện tác dụng ức chế đối với sự hình thành ban đỏ ở chuột lang do tác động của tia cực tím và sự tăng tính thấm thành mạch gây ra bởi acid acetic ở chuột nhắt. Đồng thời, quercitrin cũng không ảnh hưởng đến quá trình hình thành u hạt trong mô hình gây viêm cotton pellet và sự tiến triển của bệnh viêm khớp ở chuột cống. Các kết quả này đưa nhóm nghiên cứu đến kết luận quercitrin chỉ thể hiện tác dụng chống viêm cấp tính [29].
Theo nghiên cứu của Zakarin Z.A và cộng sự, quercitrin có tác dụng chống ung thư dạ dày trong mô hình gây ung thư bằng cách thắt môn vị. Tác dụng này là do quercitrin làm tăng pH dạ dày, giảm thể tích dịch vị, giảm nồng độ acid toàn phần và acid tự do, đồng thời làm tăng tiết chất nhầy bảo vệ tế bào niêm mạc dạ dày [35].
Vì vậy, quercitrin có thể là một trong những thành phần tạo ra tác dụng chống viêm cấp của cây Dây đòn gánh.
+ Catechin có nhiều tác dụng rất phong phú, là một chất không độc, chiếm tỷ lệ cao trong nhóm polyphenol và đã đem lại nhiều lợi ích cho con người.
45
Catechin trong chè có khả năng làm tăng độ đàn hồi và giảm tính thấm của vi huyết quản, củng cố tính bền thành mạch máu, vì vậy catechin thường được dùng phối hợp với vitamin E trong dự phòng điều trị chảy máu cấp.
Ở châu Âu từ lâu đã dùng catechin làm thuốc cầm máu (dạng rượu, siro), giải độc do alcaloid, làm nước rửa trong bệnh lậu, giang mai (dung dịch 1%), dùng chữa eczema (thuốc mỡ 5%), băng cho bệnh nhân bỏng, kích thích miễn dịch. Catechin còn được dùng rộng rãi trong y học để chữa các bệnh liên quan đến bộ máy tuần hoàn như bệnh giòn mạch máu, bệnh huyết áp [10].
Catechin có khả năng bảo vệ các protein và ADN khỏi sự phá hủy của quá trình oxy hóa, ức chế di căn do ngăn hình thành các vi quản mới nuôi khối u và là chất kìm hăm sự phát triển của khối u bằng cách phá vỡ sự gắn kết của chất sinh ung thư và những vi khuẩn với tế bào, vì vậy catechin được ứng dụng điều trị một số bệnh ung thư rất tốt. Một nghiên cứu ở Nhật cho thấy catechin có tác dụng tốt cho ung thư dạ dày và ung thư kết tràng. Nghiên cứu ở Mỹ cho biết nó có khả năng chống khối u ở da, giảm tổn thương do tia UV [8].
Catechin do khả năng ức chế các nhân tố gây viêm, kháng một số vi khuẩn bằng cách hoạt hóa các vi khuẩn có ích nhưng ức chế hoạt động của các vi khuẩn độc hại trong đường ruột nên có thể dùng catechin để chữa tiêu chảy, chống viêm loét bảo vệ răng lợi ... ngoài ra catechin còn ức chế nhiều loại vi khuẩn khác như tụ cầu, liên cầu, trực khuẩn thương hàn, vi khuẩn gây viêm phổi vì vậy có thể dùng làm thuốc sát trùng ngoài ra và nhiều bệnh khác do vi khuẩn gây nên, dùng làm thuốc săn se, chống loét, khử mùi (bảo vệ răng lợi, giữ cho hơi thở thơm tho) [8].
Vì vậy, catechin có thể là một trong những thành phần tạo ra tác dụng chống viêm của cây Dây đòn gánh.
Các kết quả nghiên cứu về hóa học trên đây sẽ là cơ sở để tiếp tục quá trình tìm hiểu và khám phá về thành phần hóa học của cây Dây đòn gánh.
46
4.2. Về độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp
Dựa vào kết quả thăm dò tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn n – Hexan, EtOAc, n- BuOH và nước; trong đó phân đoạn EtOAc có tác dụng chống oxy hóa cao nhất trong 4 phân đoạn thử nghiệm, mà quá trình oxy hóa và phản ứng viêm có quan hệ với nhau và để tiếp nối chuỗi đề tài tổng thể về cây Dây đòn gánh; phân đoạn EtOAc đã được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu sâu hơn về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học.
Kinh nghiệm sử dụng cây Dây đòn gánh trong nhân dân với công dụng chữa sưng tấy, đau nhức xương khớp do đòn đánh, do chấn thương, vết thương hở .... Từ đó đặt ra câu hỏi phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh có hay không tác dụng chống viêm? Do vậy trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của phân đoạn EtOAc.
Mặt khác để đảm bảo độ an toàn và ý nghĩa đề tài này cũng như các đề tài nghiên cứu về sau khi đánh giá tác dụng sinh học chúng tôi tiến hành thử độc tính cấp của cao toàn phần EtOH phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh trước khi nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của phân đoạn EtOAc.
4.2.1. Về độc tính cấp
Một tài liệu xác định sơ bộ thấy LD50 tiêm màng bụng của cao khô Dây đòn gánh là 500mg/kg, nhưng một tài liệu khác lại ghi đã thử đến 1000mg/kg chuột nhắt trắng nhưng không thấy chuột chết. Trong một tài liệu khác đã thử cho chuột uống đến 4000 mg/ kg cao toàn phần MeOH, sau 48h không thấy chuột chết hay có dấu hiệu ngộ độc [16].
Trong nghiên cứu này đã thử đến 12g cao toàn phần EtOH/kg thể trọng chuột nhắt trắng, nhưng không thấy chuột chết hay có dấu hiệu ngộ độc. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên trong và ngoài nước thử tới mức liều 12g cao toàn phần EtOH/kg chuột nhắt trắng uống (Tương đương 600g dl/ ngày ở người, gấp 37 -75 lần liều dùng hàng ngày). Kết quả hoàn toàn phù hợp với các công bố nghiên cứu trước đây.
47
Do vậy có thể kết luận dùng cây Dây đòn gánh theo đường uống ít độc tính và độ an toàn rộng ở mức liều 600gdl/ ngày ở người.
4.2.2. Về tác dụng chống viêm cấp
Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carragenin đã được Winter khởi xướng từ những năm 60 của thế kỷ trước [31], nhưng cho đến nay, đây vẫn là mô hình được sử dụng phổ biến khi nghiên cứu về tác dụng chống viêm của thuốc trên động vật thực nghiệm.
Carrageenin là chất sulfopolygalactosid, chiết xuất từ Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm, rẻ tiền, sẵn có ở nhiều nơi trên thế giới, ở Việt Nam carragenin có nhiều trong một loại tảo đỏ ở bờ biển đồng thời carragenin là chất tan trong nước tạo thành dung dịch, do đó sẽ tiêm được liều chính xác, tạo độ phù ổn định [6]. Carragenin được sử dụng để gây phù có bản chất là polysaccharid gần giống với cấu trúc vỏ vi khuẩn, là kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức, các mô hình gây viêm bằng carrageenin sẽ khởi động quá trình viêm cấp, bản chất của quá trình này là sự đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Vì vậy đề tài lựa chọn carragenin là tác nhân gây phù thực nghiệm. Khi gây phù bằng carragenin, phản ứng viêm gồm 2 giai đoạn khác nhau. Giai đoạn 1 (0- 2,5 giờ sau khi tiêm carragenin), cơ thể giải phóng ra một loạt các chất trung gian gây viêm như histamin, serotonin, kinin gây phá hủy xung quanh các mô. Giai đoạn 2 (3- 6 giờ sau khi tiêm), đại thực bào giải phóng ra bradykinin, leukotrien và prostagrandin. Giai đoạn này kéo dài do sự giải phóng ra prostagrandin [34]. Vì vậy đề tài lựa chọn các mốc thời gian đo độ phù là 3h, 5h và 24h sau khi tiêm. Các thuốc có tác dụng làm giảm phù trên mô hình có thể có tác dụng ức chế riêng lẻ hoặc đồng thời các chất trung gian hóa học trên.
Do vậy luận văn sử dụng mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenin để đánh giá khả năng chống viêm cấp của cao phân đoạn EtOAc cây Dây đòn gánh so với chất chuẩn diclofenac.
48
Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đường dùng là đường uống, liều dùng hàng ngày của cây Dây đòn gánh là 8 – 16g dl/ ngày, tương đương 0,16 – 0,32 g dl/ kg ở người (quy ước trung bình người lớn nặng 50 kg). Mẫu thử cao phân đoạn EtOAc chiết xuất từ phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh. Tiến hành ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm để tính liều dùng ở chuột cống trắng là 1,28 – 2,56 g dl/ kg (theo hệ số 8).
Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên chuột cống trắng, chúng tôi lựa chọn 2 mức liều là 2,4 g và 4,8 g dl/ kg đối với cao phân đoạn EtOAc.
Cả 2 liều đều có tác dụng giảm phù hơn so với lô chứng, khi tăng liều tác dụng giảm phù có xu hướng tăng, tuy nhiên sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê, do vậy tác dụng chống viêm cấp là kém.
Có thể kết luận cao phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng chống viêm cấp kém và không đáng kể trên mô hình gây phù bàn chân chuột bởi carragenin ở mức liều 4,8gdl/kg.
Hiện chưa có nghiên cứu nào trong và ngoài nước đánh giá tác dụng chống viêm cấp của cao phân đoạn EtOAc trên mô hình gây phù bàn chân chuột bởi carragenin. Kết quả bước đầu này sẽ cho phép kết luận sơ bộ về tác dụng chống viêm cấp trên cao phân đoạn EtOAc của cây Dây đòn gánh. Tuy nhiên, theo Tô Thị Mai Dung [30], dịch chiết toàn phần methanol của cây Dây đòn gánh có tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm dạ dày do HCl/ EtOH gây ra. Do vậy sẽ gợi ý hướng nghiên cứu tiếp theo trên phân đoạn này ở mô hình gây viêm khác và nghiên cứu trên các phân đoạn khác cũng như cao toàn phần.
Mô hình dễ áp dụng và khá nhạy để đánh giá bước đầu về khả năng chống viêm của một thuốc. Theo kinh nghiệm sử dụng trong nhân dân và các nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm và giảm đau, các hợp chất phân lập
49
được cũng đều có tác dụng chống viêm, tuy nghiên kết quả thu được trong nghiên cứu này là âm tính ở mức liều 4,8gdl/kg. Phải chăng điều kiện và thời gian bảo quản làm thay đổi thành phần dẫn đến thay đổi tác dụng hay có sự thay đổi điều kiện sinh thái, mùa thu hái ( mẫu nghiên cứu được thu hái vào tháng 11/2016 – mùa đông, khi cây đang có quả, mà bộ phận dùng là phần trên mặt đất, theo lý thuyết thu hái nên thu hái khi cây bắt đầu ra hoa là lúc cây có hàm lượng hoạt chất cao nhất); hoặc nồng độ mẫu chưa đủ để thể hiện tác dụng ?
Như vậy điều kiện sinh thái, mùa thu hái, điều kiện bảo quản, thời gian bảo quản, nồng độ thử ... có ảnh hưởng như thế nào và làm sao để có mẫu cho tác dụng tốt nhất là những vấn đề cần quan tâm bởi trong thực tế hiện nay cây Dây đòn gánh vẫn đang được tiếp tục sử dụng trong dân gian để điều trị bệnh đau cơ xương khớp cấp tính như sưng tấy, đau nhức do đòn đánh, chấn thương ...
50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau thời gian làm thực nghiệm đã thu được những kết quả sau:
1. Về hóa học
Đã định tính được thành phần hóa học trong cây Dây đòn gánh có các nhóm chất:flavonoid, saponin triterpenoid, đường khử, caroten và sterol.
Đã phân lập được 2 hợp chất từ cắn phân đoạn EtOAc trên cây Dây đòn gánh là DG3 và DG5. Dựa vào số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT. HMBC, HSQC đã xác định được DG3 và DG5 lần lượt là quercitrin và catechin. Đây là 2 hợp chất có mặt trong nhiều cây, tuy nhiên lần đầu tiên được tìm thấy từ phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh.
2. Về độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp - Về độc tính cấp:
Đã thử các liều 4g, 8g, 12 g cao toàn phần EtOH/ kg chuột nhắt trắng tương đương 48g, 96g, 144 g dl/ kg, quy đổi ngoại suy liều tối đa trên người là 600 g dl/ ngày (gấp 37 – 75 lần liều dùng hàng ngày) mà chuột không chết hay có dấu hiệu ngộ độc ở các lô thử nghiệm.