Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M±SE). Đánh giá, so sánh giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t-Student
24
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nguyên cứu hóa học của cây Dây đòn gánh
3.1.1. Xác định độ ẩm của dược liệu
Lấy khoảng 8g bột dược liệu nghiên cứu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1050
C. Đổ dược liệu lên đĩa cân, trải đều bột dược liệu trên mặt đĩa, đợi máy tự động hiện kết quả trên màn hình, sau 10 phút đọc kết quả. Độ ẩm dược liệu nghiên cứu (phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh) là 9,986 %.
Bảng 3.1: Xác định độ ẩm của mẫu cây Dây đòn gánh
Khối lƣợng (g) Độ ẩm (%)
Lần 1 2,1741 10,136
Lần 2 2,7684 9,722
Lần 3 2,1061 10,100
Trung bình 2,3495 9,986
3.1.2. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong cây Dây đòn gánh
Kết quả định tính các nhóm chất chính bằng phản ứng hóa học đặc trưng được thể hiện quaBảng 3.2
25
Bảng 3.2: Tóm tắt kết quả định tính các nhóm chất chính trong cây Dây đòn gánh
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận sơ bộ
1 Flavonoid
P/ư Cyanidin +++
Có
P/ư với NaOH 10% +++
P/ư với FeCl3 5% ++
2 Saponin P/ư tạo bọt +++ Có
3 Alcaloid
P/ư thuốc thử Mayer -
Không có P/ư thuốc thử Bourchardart -
P/ư thuốc thử Dragendorff - 4 Saponin
triterpenoid P/ư Salkowski ++ Có
5 Coumarin P/ư mở vòng lacton - Không có
6 Tanin P/ư với dd Gelatin 1% -
Không có
P/ư với FeCl3 5% +++
7 Glycosid tim P/ư Liebermann Bouchardart ++
Không có P/ư thuốc thử Baljet -
8 Đường khử P/ư thuốc thử Felling ++ Có
9 Acid hữu cơ P/ư với Na2CO3 - Không có
10 Acid béo Bay hơi trên giấy lọc - Không có
11 Caroten P/ư với H2SO4 đặc ++ Có
12 Sterol P/ư Liberman ++ Có
13 Polysacharid P/ư với thuốc thử Lugol 1% - Không có
Chú thích: + : Phản ứng dương tính. - : Phản ứng âm tính.
Kết quả định tính sơ bộ cho thấy phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh có chứa các nhóm chất flavonoid, saponin triterpenoid, đường khử, caroten và sterol.
26
3.1.3. Chiết xuất
Quy trình chiết xuất các cao từ phần trên mặt đất của cây Dây đòn gánh được mô tả tóm tắt trong Hình 2.2, Chƣơng 2
3.1.4. Phân lập
- Quy trình phân lập:
Cao phân đoạn EtOAc (36 g) được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường (silica gel- Merck, đường kính cột 7 cm, chiều dài 80 cm); mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel; rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần (30:1; 10:1 đến 5:1). Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau, thu được 06 nhóm phân đoạn chính: PĐ1, PĐ2, PĐ3, PĐ4, PĐ5, PĐ6.
Nhóm phân đoạn PĐ4 (3.8 g) đưa lên cột silica gel pha đảo RP18 (cột có đường kính 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O tỷ lệ MeOH tăng dần (1:2; 1:1 đến 2:1). Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau thu được 03 nhóm phân đoạn chính PĐ 4.1, PĐ 4.2, PĐ 4.3.
Nhóm phân đoạn PĐ 4.2 (0,258g) tiếp tục được phân tách bằng cột sephadex ( sephadex LH20, cột đường kính 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng dung môi MeOH, thu được PĐ 4.2.1.
Nhóm phân đoạn PĐ 4.2.1 (0,151g) tiếp tục được phân tách bằng cột
silica gel pha đảo RP18 (cột có đường kính 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (2:3). Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau, thu được 2 nhóm phân đoạn PĐ 4.2.1.1, PĐ 4.2.1.2.
Nhóm phân đoạn PĐ 4.2.1.1 (0,072g) tiếp tục được phân tách bằng cột sephadex (sephadex LH20, cột đường kính 1 cm, chiều dài 70 cm) sử dụng dung môi MeOH làm pha động thu được hợp chất DG3 (28 mg).
27
Nhóm phân đoạn PĐ 4.3 (0,26 g) được đưa lên cột silica gel pha đảo (đường kính cột 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (2:3) làm pha động. Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau, thu được 2 phân đoạn chính PĐ 4.3.1, PĐ 4.3.2.
Nhóm phân đoạn PĐ 4.3.1 (0,098 g) được đưa lên cột sephadex (sephadex LH20, cột đường kính 1 cm, chiều dài 70 cm) sử dụng dung môi MeOH làm pha động thu được hợp chất DG5 (30 mg).
Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc được tóm tắt trong sơ đồ Hình 3.1
28
Hình 3.1: Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc
Cao phân đoạn EtOAc 36g PĐ 1 PĐ 2 PĐ 3 PĐ 4 3,8g PĐ 5 PĐ 4.1 PĐ 4.2 PĐ 4.3 0,26g 0,258g PĐ 4.2.1.2 PĐ 4.2.1.1 0,072g PĐ 4.3.1 0,098g PĐ 4.2.1 0,151g DG3 28mg PĐ 4.3.2 SKC silica gel DM: CH2Cl2/MeOH (D/M) D/M:30:1 D/M:10:1 D/M:10:1 D/M:5:1 D/M:5:1 SKC RP18 DM:MeOH/H20 (M/H) M/H: 1:2 M/H: 1:1 SKC Sephadex DM: MeOH SKC RP18 DM:MeOH/H20 (2:3) SKC RP18 DM:MeOH/H20 (2:3) SKC Sephadex DM: MeOH SKC Sephadex DM: MeOH PĐ 6 DG5 30 mg D/M:5:1 M/H: 2:1
29
3.1.5. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được
3.1.5.1. Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM
Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là Toluen - Ethyl acetat – Acid acetic – Acid fomic (5:2:2:1), vết chất được quan sát bằng đèn tử ngoại (ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm) và sử dụng thuốc thử hiện màu là hỗn hợp acid boric : acid oxalic (tỷ lệ 2/1) 10%/ nước, sấy trong khoảng 10 phút ở 105oC. Quan sát ở bước sóng 365 nm và ánh sáng thường. Kết quả thu được như Hình 3.2 và Hình 3.3.
+ SKLM của DG3
A B C D
Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng DG3 so với cao EtOH và cao EtOAc ở hệ dung môiToluen - Ethyl acetat – Acid acetic – Acid fomic
(5:2:2:1)
Ghi chú: A: Hình ảnh quan sát ở UV 254 nm trước khi phun thuốc thử. B: Hình ảnh quan sát ở UV 365 nm trước khi phun thuốc thử. C: Hình ảnh quan sát UV 365 nm sau khi phun thuốc thử
30
Nhận xét:
Sắc ký đồ của hợp chất DG3 có Rf = 0,227.
Sắc ký đồ của DG3 trước khi phun thuốc thử: quan sát ở UV 254 nm thấy có 1 vết duy nhất, quan sát ở UV 365nm không quan sát thấy vết nào.
Sắc ký đồ của DG3 sau khi phun thuốc thử: quan sát ở UV 365 thấy có 1 vết phát quang màu xanh sáng, quan sát ở ánh sáng thường vết có màu vàng.
Có thể thấy rằng, chất DG3 phân lập được tương đối tinh sạch.
+ SKLM của DG5:
A1 B1 C1 D1
Hình 3.3 : Hình ảnh sắc ký lớp mỏng DG5 so với cao EtOH và cao EtOAc ở hệ dung môiToluen - Ethyl acetat – Acid acetic – Acid fomic
(5:2:2:1)
Ghi chú: A1: Hình ảnh quan sát ở UV 254 nm trước khi phun thuốc thử. B1: Hình ảnh quan sát ở UV 365 nm trước khi phun thuốc thử. C1: Hình ảnh quan sát UV 365 nm sau khi phun thuốc thử
31
Nhận xét:
Sắc ký đồ của hợp chất DG5 có Rf = 0,325.
Sắc ký đồ của DG5 trước khi phun thuốc thử: quan sát ở UV 254 nm thấy có 1 vết duy nhất, quan sát ở UV 365nm không quan sát thấy vết nào.
Sắc ký đồ của DG5 sau khi phun thuốc thử: quan sát ở UV 365 thấy có 1 vết phát quang màu xanh sáng, quan sát ở ánh sáng thường vết có màu vàng.
Có thể thấy rằng, chất DG5 phân lập được tương đối tinh sạch.
3.1.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC
a) Chất DG3
Điều kiện tiến hành phân tích:
Cột pha đảo Ascentis C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm), pha động khảo sát là hệ dung môi MeOH/nước và Acetonitril/H2O gradient, thấy hệ dung môi Acetonitril/H2O là tối ưu. Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 20 μl, detector UV-VIS 210 nm. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất DG3 được thể hiện trên Hình 3.4
32
Hình 3.4: Hình ảnh sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất DG3
Kết quả Hình 3.4 cho thấy, hợp chất DG3 phân lập được tương đối tinh sạch (độ tinh sạch đạt 92,145 %, tính theo diện tích pic HPLC, quan sát UV- 210 nm).
b) Chất DG5
Điều kiện tiến hành phân tích:
Cột pha đảo Ascentis C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm), pha động khảo sát là hệ dung môi MeOH/nước và Acetonitril/H2O gradient, thấy hệ dung môi Acetonitril/H2O là tối ưu. Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 20 μl, detector UV-VIS 254 nm. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất DG5 được thể hiện trên Hình 3.5
33
Hình 3.5: Hình ảnh sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất DG5
Kết quả Hình 3.5 cho thấy, hợp chất DG5 phân lập được tương đối tinh sạch (độ tinh sạch đạt 97,683 %, tính theo diện tích pic HPLC, quan sát UV- 254 nm).
3.1.6. Xác định cấu trúc các chất phân lập được
3.1.6.1. Chất DG3
Hợp chất DG3 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 180 - 184o
C.
Phổ 1H-NMR của DG3 xuất hiện tín hiệu của 05 proton thơm bao gồm hai proton được xác định ở vị trí meta với nhau ở δH 6,23 (1H; d; 1,5), 6,39 (1H; d; 1,5), 03 proton còn lại được xác định thuộc vào một vòng thơm có hệ tương tác ABX ở δH 7,36 (1H; d; 2,0), 6,93 (1H; d; 8,5), 7,33 (1H; dd; 2,0; 8,0). Ngoài các tín hiệu proton kể trên, phổ 1H-NMR của DG3 còn xuất hiện tín hiệu của phần đường bao gồm: một proton anomer ở δH 5,37 (1H; d; 1,5), 4 tín hiệu proton oxymethin khác tại δH 4,23 (1H; dd; 3,3; 1,7); 3,77 (1H; dd; 9,5; 3,5); 3,36 (1H; t; 9,5); 3,44 (1H; dd; 6,5; 10), và một tín hiệu của một nhóm methyl gắn với gốc đường tại δH 0,96 (3H; d; 6,0) gợi ý cho sự xuất hiện của một phân tử đường rhamnose
34 Phổ 13
C-NMR của DG3 xuất hiện tín hiệu của 21 cacbon, trong đó 6 carbon thuộc vào một phân tử đường (δ103,56; 72,04; 72,15; 73,28; 71,92; 17,65 ppm).
Phổ DEPT cho thấy trong cấu trúc DG3 có 1 nhóm CH3, 10 nhóm CH và có 10 carbon bậc 4.
Dựa vào sự phân tích dữ liệu phổ nêu trên hợp chất DG3 có công thức phân tử C21H20O11, KLPT 448,38, cùng với so sánh dữ liệu phổ đã công bố [17], cho phép khẳng định hợp chất DG3 là quercetin-3-O-α-L- rhamnopyranosid, còn gọi là quercitrin. Hợp chất này có mặt trong nhiều cây, tuy nhiên đây là lần đầu tiên được tìm thấy trong cây Dây đòn gánh.
35
Bảng 3.3. Số liệu phổ 1
H và 13C-NMR của hợp chất DG3 và Quercitrin
Vị trí
Hợp chất DG3 Tài liệu tham khảo[17]
δHa ppm (số H, độ bội, J=Hz) δCa (ppm) δHa ppm (số H, độ bội, J=Hz) δCa (ppm) 2 - 158,56 - 158,6 3 - 136,26 - 136,3 4 - 179,68 - 179,7 5 - 163,25 - 163,3 6 6,23 (1H; d; 1,5) 99,84 6.20 (1H; d; 2,1) 99,9 7 - 165,91 - 165,9 8 6,39 (1H; d; 1,5) 94,72 6.36 (1H; d; 2,2) 94,8 9 - 159,33 - 159,4 10 - 105,93 - 106,0 1′ - 123,00 - 123,1 2′ 7,36 (1H; d; 2,0) 116,96 7.34 (1H;d; 2,1) 117,1 3′ - 146,44 - 149,9 4′ - 149,82 - 146,5 5′ 6,93 (1H; d; 8,5) 116,39 6.92 (1H; d; 8,3) 116,5 6′ 7,33 (1H; dd; 2,0; 8,0) 122,87 7.31 (1H; dd; 8,3; 2,1) 122 1′′ 5,37 (1H; d; 1,5) 103,56 5.36 (1H; d; 1,6) 103,6 2′′ 4.23 (1H; dd; 3,3; 1,7) 71,92 4.23 (1H; dd; 3,3; 1,7) 72 3′′ 3,77 (1H; dd; 9,5; 3,5) 72,15 3.77 (1H; dd; 9,4; 3,4) 72,3 4′′ 3,36 (1H; t; 9,5) 73,28 3.36 (1H; t; 9,5) 73,4 5′′ 3,44 (1H; dd; 6,5; 10) 72,04 3.44 (1H; dd; 9,6; 6,1) 72,1 6′′ 0.96 (3H; d; 6,0) 17,65 0.95 (3H; d; 6,2) 17,7
36
Công thức cấu tạo hóa học của DG3 (Quercitrin):
Hình 3.6. Sơ đồ cấu tạo hóa học DG3
3.1.6.2. Chất DG5
Hợp chất DG5 thu được có nhiệt độ nóng chảy 175 - 176oC.
Phổ khối ion hóa bụi điện tử (ESI-MS) của 3 cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 291 [M+H]+, gợi ý chất DG5 có CTPT là C15H14O6. Phổ 1
H-NMR cho biết các proton của vòng thơm, gồm 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX ở δH 6,74 (1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz, H-6′); 6,78 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′); và 6,86 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′); 2 proton ở vị trí meta trong vòng benzen ở δH 5,88 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) và 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8). Như vậy, DG5 có 2 vòng thơm nên nhiều khả năng nó là một flavonoid. Ngoài ra, phổ
1
H-NMR còn có một tín hiệu của hai tín hiệu proton thuộc nhóm methylen (CH2) ở δH 2,53 (1H, dd, J=16,0; 8,0 Hz, H-4β); 2,87 (1H, dd, J=16,0; 5,5 Hz, H-4α); hai tín hiệu proton của hai nhóm metin gắn với oxi tại δH 4,59 (1H, d,
J=7,5 Hz, H-2) và 4,00 (1H, ddd, J=8,0; 7,5; 5,5 Hz, H-3). Phổ 13C-NMR cho biết có 15 tín hiệu carbon, trong đó có 12 tín hiệu thuộc vòng thơm hoặc liên kết đôi (Bảng dưới), hai tín hiệu carbon thuộc nhóm methin (CH) tại δC 82,86 và 68,82 ppm (đều gắn với Oxi); và một tín hiệu carbon thuộc nhóm methylen
37
(CH2) tại δC 28,51 ppm. Kết hợp với dữ liệu phổ 1
H-NMR giúp khẳng định chắc chắn rằng DG5 là một flavonoid và thuộc nhóm flavan.
Từ các dữ liệu phổ trên cho phép kết luận chất DG5 là một flavonoid thuộc nhóm flavan có vòng A và B đều bị thế ở 2 vị trí. Hai proton tại vị trí số 2 và 3 có hằng số tương tác J = 7,5 Hz ( H-2 và H-3) cho biết chúng ở vị trí transdiaxial. Chất DG5 có nhiệt độ nóng chảy tại 175-176oC, [ ]D + (MeOH,
c 0,1) nên nó được xác định là (+)-catechin. Sự có mặt của 15 nguyên tử cacbon trên phổ 13C-NMR tương ứng với 1 nhóm metylen, 2 nhóm metin có gắn với oxi, 5 nhóm metin của vòng thơm và 7 cacbon bậc 4 là hoàn toàn phù hợp với dự đoán trên. Sau khi so sánh các số liệu phổ của DG3 với tài liệu tham khảo [9], chúng tôi đi đến kết luận chất DG3 là (+)-catechin có CTPT C15H14O6. Hợp chất này có mặt trong nhiều cây, tuy nhiên đây là lần đầu tiên được tìm thấy trong cây Dây đòn gánh.
38
Bảng 3.4. Số liệu phổ 1
H và 13C-NMR của hợp chất DG5 và Catechin
Vị trí
Hợp chất DG5 Tài liệu tham khảo [7]
δH a (số H, độ bội, J=Hz) ppm δC a (ppm) δH a (số H, độ bội, J=Hz) ppm δC a (ppm) 2 4,59 (1H; d; 7,5) 82,86 4,59 (1H; d; 7,6) 82,6 3 4,00 (1H; ddd; 8,0; 7,5; 5,5) 68,82 4,00 (1H; ddd; 8,2; 7,6; 5,4) 68,6 4 2,87 (1H; dd; 16; 5,5) 2,53 (1H; dd; 16,0; 8,0) 28,51 2,88 (1H; dd; 16,1; 5,4) 2,53 (1H; dd; 16,1; 8,2) 28,3 5 - 157,57 - 157,3 6 5,88 (1H; d; 2,0) 96,34 5,89 (1H; d; 2,2) 96,2 7 - 156,92 - 156,7 8 5,95 (1H; d; 2,0) 95,54 5,95 (1H; d; 2,2 ) 95,4 9 - 157,84 - 157,5 10 - 100,86 - 100,7 1′ - 132,25 - 131,9 2′ 6,86 (1H; d; 2,0) 115,29 6,86 (1H; d; 1,9) 115,1 3′ - 146,23 - 146,0 4′ - 146,25 - 146,0 5′ 6,78 (1H; d; 8,0) 116,11 6,79 (1H; d; 8,2) 116,0 6′ 6,74 (1H; dd; 8,0;2,0) 120,05 6,74 (1H; dd; 8,2; 1,9) 119,9
39 Sơ đồ cấu tạo hóa học của DG5 (Catechin):
O OH OH OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6'
Hình 3.7. Sơ đồ cấu tạo hóa học DG5
3.2. Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp
3.2.1. Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp của cao toàn phần EtOH
3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu
Tiến hành nghiền nhỏ và hòa cắn cao EtOH trong nước cất với nồng độ: 100, 200, 300 mg cao EtOH/ml nước cất. Cho chuột trong tất cả các lô uống cùng thể tích 0,4ml/ 10g thể trọng chuột.
Kết quả thí nghiệm khi cho 3 lô chuột uống mẫu thử ở các liều tương đương 48g, 96g, 144g dược liệu/kg thể trọng chuột nhắt trắng; theo dõi thấy chuột không có biểu hiện gì đặc biệt, vẫn hoạt động, ăn uống bình thường, không có biểu hiện mệt mỏi, bài tiết bình thường.
Thể tích tối đa cho chuột uống là 40ml/kg, nồng độ 300mg cao/ml đây cũng là thể tích và nồng độ đậm đặc nhất có thể cho uống trên chuột nhắt bằng kim đầu tù chuyên dụng.
Sau 72 giờ theo dõi, không có chuột nào chết, tỷ lệ chuột sống 100%.
3.2.1.2. Kết luận
- Không vẽ được đồ thị hồi quy tuyến tính giữa liều lượng thuốc và tỷ lệ chuột chết ở các liều dùng khác nhau, nên không xác định được LD50 của cao toàn phần EtOH phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh theo đường uống bằng phương pháp Behrens-Karber.
40
- Cơ bản xác định LD50 > 144 g dược liệu khô/ kg thể trọng chuột nhắt trắng, quy đổi và ngoại suy trên người là 600g dược liệu khô/ngày. Trong khi đó liều dùng hàng ngày của cây Dây đòn gánh đang được sử dụng là 8g – 16g dược liệu/ngày.
- Với liều gấp 37 - 75 lần với liều dùng thường dùng hàng ngày phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh an toàn, chưa có độc tính. Do vậy có thể kết luận phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh có ít độc tính và độ an toàn rộng.